Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 9
Текст из файла (страница 9)
раздел I.2).Ген В2 РНК транскрибируется с помощью РНКП III и закодирован в составеB2 SINE-элементов. Точное количество SINE-последовательностей, кодирующих генВ2 РНК, на данный момент неизвестно и оценивается в ~ 350000 копий на клетку [69].Консервативная последовательность гена В2 РНК имеет длину ~ 180 н.п. и содержит в5'-области так называемые А- и Б-боксы, гомологичные промоторным элементамРНКП III. На 3'-конце В2 РНК расположен терминатор транскрипции РНКП III, а такжетри перекрывающиеся последовательности 5'-d(ААТААА)-3', являющиеся сигналамиполиаденилирования.
Транскрипция данного SINE-элемента требует наличия факторовTFIIIB и TFIIIС. Было показано, что в клетках присутствуют по крайней мере четыреформы В2-транскриптов различной длины: ~ 150, ~ 180, ~ 240 и ~ 500 н.о. Две, наиболеепротяженные из них (~ 240 и ~ 500 н.о.), полиаденилированы и являются весьмастабильными (1/2 = 60 мин), тогда как время деградации на 50% полноразмерноготранскрипта (180 н.о.) составляет всего 3-4 мин. 150-Звенный вариант B2 РНК болееустойчив и характеризуется значением 1/2 порядка 20 мин [80].Вторичная структура В2 РНК была впервые определена в 2004 г.
научной группойпроф.Гудрича[76].Онаможетбытьусловноразделенанатричасти(рис. I.26): (1) протяженный двухцепочечный участок (1-72 н.о.), содержащийрасплетенный фрагмент в центре, (2) слабо структурированный участок (73-153 н.о.),содержащий три небольшие шпильки и (3) короткую неструктурированную А/T-богатуюобласть (154-178 н.о.), консервативную для всех SINE-элементов [69].Позднее теми же авторами [79] методом футпринтинга с использованиемразличных рибонуклеаз было установлено, что РНКП II связывается главным образом с443'-областью В2 РНК (73-153 н.о.). С помощью анализа делеционных мутантов былопределен участок в В2 РНК длиной 51 н.о. (81-131 н.о.), который связывается с РНКП IIи ингибирует транскрипцию in vitro с такой же эффективностью, что и полноразмернаяВ2 РНК.
Данная область состоит из 18-звенного одноцепочечного участка (SS2)(рис. I.26), фланкированного двумя шпилечными структурами (S4/L4 и S5/L5). Приудалении шпильки S4/L4 оставшийся фрагмент B2 РНК (99-131 н.о.) по-прежнемуспецифически связывался с РНКП II, однако терял способность к ингибированиютранскрипции.Было показано, что оба функциональных фрагмента B2 РНК (81-131 н.о. и99-131 н.о.) образуют РНК-белковые контакты с РНКП II при сборке ПИК на промотореДНК, но только 51-звенный участок (81-131 н.о.) блокирует сборку элонгационногокомплекса. Данный факт свидетельствует о том, что белок содержит два различныхцентра связывания: активный центр, блокирование которого приводит к глобальномуингибированию синтеза мРНК, и дополнительный («doking») центр, высокоспецифичныйк некодирующим РНК.
Вместе с тем, наличие 5'-области В2 РНК (1-80 н.о.) не являетсяобязательным для связывания молекулы с РНКП II или репрессии транскрипции.Рис. I.26. Предполагаемая вторичная структура В2 РНК (1-155 н.о.) на основе данныххимического и ферментативного пробинга [79]. Отмечены н.о., гидролизующиеся при действииMgCl2 (*), РНКазы V1 (●), РНКазы I (∆), РНКазы Т2 (○), РНКазы Т1 (□). Неструктурированный3'-концевой участок (154-178 н.о.) опущен. Рамкой выделена функциональная часть В2 РНК (81 131 н.о.).45Предполагают, что механизм взаимодействия В2 РНК с РНКП II может бытьаналогиченсоответствующему дляFCРНК(разделI.3.1)илибактериальной6S РНК (раздел I.2) с РНКП несмотря на то, что вторичные структуры этих РНКсущественно отличаются от РНКП-связывающей области В2 РНК.
Тем не менее,Kd комплексов B2 РНК с РНКП II мыши и FC РНК с дрожжевой РНКП II равны (~ 30 нМ),а избыток одной РНК может эффективно вытеснять другую из её комплекса с РНКП [67].Методом «торможения в геле» с одновременным использованием флуоресцентномеченного фрагмента ДНК, содержащего промотор AdMLP (основной поздний промотораденовируса), и32P-меченной В2 РНК было показано, что оба лиганда входят в составПИК РНКП II и мигрируют в геле совместно, несмотря на частичное вытеснениеДНК-промотора избытком В2 РНК (рис. I.27). Данный комплекс характеризуется большейподвижностью в агарозном геле, чем ПИК РНКП II с промотором AdMLP, и образуетсятолько при долговременном присутствии В2 РНК в реакционной смеси.
Вероятно,наличие В2 РНК повышает отрицательный заряд комплекса, или в данном случае имеетместо конформационные изменения в ПИК. Так же нельзя исключить, что В2 РНК можетспособствовать высвобождению определенной субъединицы полимеразы из ПИК.Отсутствие хотя бы одного из трех транскрипционных факторов TBP, TFIIB и TFIIFпредотвращает образование подобных комплексов, а обработка ПИК, содержащегоВ2 РНК, рибонуклеазами, приводящая к гидролизу В2 РНК, «возвращает» подвижность вгеле оставшегося комплекса РНКП II с промотором ДНК до первоначального уровня [76].Рис. I.27.
В2 РНК связывает ПИК РНКП II на промоторе AdMLP с образованиемкомплексов, характеризующихся большей подвижностью в геле в неденатурирующих условиях.Формирование ПИК происходило с флуоресцентно меченной (Alexa Fluor 647) 60-звенной ДНК,содержащей промотор AdMLP, в отсутствие и присутствии 32Р-меченой В2 РНК. (А) Фотографиягеля под УФ-светом, (Б) радиоавтограф геля [76].Таким образом, В2 РНК ингибирует транскрипцию после образования стабильногокомплекса РНКП с промотором ДНК, но до начала синтеза РНК, то есть влияет главнымобразом на стадию инициации транскрипции. Стоит отметить, что наличие В2 РНК в ПИКпредотвращает не только полноразмерную транскрипцию мРНК, но и препятствуетсинтезу абортивных продуктов. Строго говоря, в эксперименте in vitro в присутствии46В2 РНК была показана возможность однораундового синтеза РНКП II тринуклеотида,однако образовавшийся комплекс был не способен ни к абортивному высвобождениюсинтезированной РНК, ни к переходу в стадию элонгации [76].Было высказано предположение, что В2 РНК предотвращает «плавление» промотораи блокирует возможность образования «открытого» комплекса, либо не позволяетнуклеозидтрифосфатам связываться в активном центре РНКП II [76].
Анализ данных покросслинкингу и футпринтингу ПИК, связанного с В2 РНК, показал, что В2 РНК мешаетобразованию контактов между РНКП II и промотором, хотя и не препятствуетвзаимодействию факторов TBP и TFIIB с ДНК. При обработке В2 РНК в составе ПИКРНКазой I все нарушенные контакты восстанавливаются. Таким образом, согласносуществующей на данный момент модели В2 РНК не разрушает ПИК, но мешаетправильной координации промотора ДНК в активном центре РНК-полимеразы, тем самымпереводя ПИК в инертную форму. По сути В2 РНК меняет конформацию «закрытого»комплекса РНК-полимеразы и препятствует его переходу в «открытый» и, тем более, винициаторный комплексы (рис.
I.28). Следует отметить, что, несмотря на отсутствие вданном случае важнейших контактов между РНКП и ДНК,фермент и всеассоциированные с ним факторы остаются связанными с промотором. Данный фактможно частично объяснить присутствием в ПИК факторов транскрипции, которыеобеспечивают наличие большого числа дополнительных взаимодействий, удерживающихмультибелковый комплекс на ДНК.Рис. I.28. Схема молекулярной организации ПИК РНКП II на промоторе ДНК [81].
В2 РНКизменяет конформацию «закрытого» комплекса РНКП II посредством связывания вблизиактивного центра фермента, блокирует возможность образования «открытого» комплекса и, какследствие, препятствует инициации транскрипции.Ранее упоминалось, что В2 РНК играет важную роль в репрессии генов мРНК приосуществленииответнойреакциивпервуюочередьнатепловойшок[75].Экспериментально подтверждено влияние В2 РНК мыши на экспрессию актина игексокиназыII.ПритрансфекцииклетокантисенсовымикданнойРНК47олигонуклеотидамипроисходилозаметноеуменьшениерепрессиитранскрипциисоответствующих генов.
Однако должен существовать и механизм, позволяющий белкамтеплового шока (например, HSP70), экспрессироваться в присутствии В2 РНК. Такжеостается неизвестным, как проходит снятие репрессии после того, как клеткивосстанавливаются после теплового шока.В ряде статей в экспериментах in vitro было показано, что ингибированиетранскрипции, вызванное В2 РНК, является обратимым процессом [76, 82]. В связи с этимпредполагается, что в клетках существует специальный фактор: РНКаза, хеликаза, другаярегуляторная нкРНК или специальный белок, который связывается с В2 РНК, вытесняя ееиз комплекса с полимеразой. В случае белков теплового шока вероятно наличиеспециального фактора транскрипции, специфичного к их генам, который напрямую можетпредотвращать ингибирующий эффект В2 РНК. Одним из наиболее распространенныхфакторов такого типа является транскрипционный активатор HSF, который связывается спромоторами генов, кодирующих белки теплового шока, и стимулирует их транскрипцию.Однако попытки зафиксировать взаимодействия между HSF и В2 РНК не привели куспеху.В разделе I.3.2.1 была охарактеризована B1 РНК мыши, связывающая РНКП II, нонепрепятствующаяеефункционированиюиз-заотсутствияконкуренциисДНК-промотором.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
