Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 14
Текст из файла (страница 14)
coli.II.1. Выделение 6S-1 и 6S-2 РНК Bacillus subtilisСтандартным способом синтеза РНК-фрагментов является транскрипция in vitro спомощью РНК-полимеразы фага T7. ДНК-зависимая РНК-полимераза T7 узнает в ДНКпоследовательность 5'-d(TAATACGACTCACTATA)-3' и начинает транскрипцию спервого нуклеотида, расположенного сразу после неё. Максимальная эффективностьсинтеза РНК наблюдается, если следующая за промотором последовательностьначинается с гексануклеотида 5'-d(GGGAGA)-3', однако уже двух остатков dG вположениях +1 и +2 достаточно для высоких выходов транскриптов [129].
В соответствиис этими «требованиями» на основе вектора pUC18 (содержащего ген устойчивости кампициллину) нами были сконструированы плазмиды pBB_T7_bsrA и pBB_T7_bsrB,несущие гены bsrA (6S-1 РНК) и bsrB (6S-2 РНК), под контролем Т7-промотора (рис. II.1).Поскольку последовательность гена 6S-1 РНК начинается с dА, а гена 6S-2 РНК – с dG,данные конструкции содержали дополнительно два остатка dG перед геном bsrA и одиностаток dG перед геном bsrB.Рис. II.1.
Схемы плазмид pBB_T7_bsrA (А) и pBB_T7_bsrB (Б) с указанием расположенияосновных элементов.Плазмиды трансформировали в клетки E. coli штамма DH5α. После культивацииполученных клеточных линий в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) проводиливыделение плазмид как описано в главе «Экспериментальная часть». Как правило, из500 мл клеточной культуры удавалось выделить ~ 200-400 мкг гомогенной плазмиднойДНК. Для перевода плазмид в линейную форму их гидролизовали эндонуклеазой66рестрикции HindIII. Степень расщепления ДНК проверяли методом электрофореза в1%-ном агарозном геле (рис.
II.2А).Рис. II.2. (А) Оценка эффективности гидролиза плазмидных ДНК pBB_T7_bsrA иpBB_T7_bsrB эндонуклеазой рестрикции HindIII. Формы ДНК: SC – суперскрученная, С –кольцевая, L – линеаризованная. Дорожки 2 и 4 – плазмидная ДНК (~ 0,2 мкг), содержащая геныbsrA и bsrB, до гидролиза, дорожки 3 и 5 – плазмидная ДНК (~ 0,5 мкг), содержащая гены bsrA иbsrB, после гидролиза R.HindIII, дорожка 1 – ДНК-маркер (длина фрагментов (н.п.) указана слева).Фотография под УФ-светом 1%-ного агарозного геля, окрашенного раствором бромида этидия.(Б) Анализ продуктов Т7-транскрипции генов bsrA и bsrB (дорожки 3 и 5) и выделенныхпрепаратов 6S-1 и 6S-2 РНК (дорожки 2 и 4, ~ 1 мкг РНК). Дорожка 1 – РНК-маркер (длинафрагмента, н.о., указана слева).
Фотография под УФ-светом 8%-ного ПААГ, содержащего7 М мочевину и окрашенного раствором бромида этидия.Линеаризованные ДНК использовали в качестве матриц для Т7-транскрипции,которую проводили по стандартному протоколу (см. главу «Экспериментальная часть»).Продукты транскрипции экстрагировали, осаждали этанолом, и выделяли из 8%-ногоПААГ, содержащего 7 M мочевину. На рис. II.2Б приведен результат ферментативногосинтеза 6S-1 и 6S-2 РНК. Видно, что в процессе транскрипции наблюдается значительнаядеградация полученных РНК и/или синтез побочных продуктов (рис.
II.2Б, дорожки 3 и 5).Применяемая методика пост-транскрипционной очистки препаратов 6S РНК позволяетполностью избавиться от нежелательных примесей (рис. II.2Б, дорожки 2 и 4). Длинаполученных 6S-1- и 6S-2-транскриптов также соответствует рассчитанной: 192 н.о. для6S-1 РНК и 204 н.о. для 6S-2 РНК. Таким образом, были выделены гомогенные препараты6S-1 и 6S-2 РНК из B. subtilis в значительных количествах: ~ 400-600 мкг в ходе однойреакции Т7-транскрипции (объем реакционной смеси – 0,5 мл, количество ДНК-матрицы– 40 мкг).67II.
2. Выделение РНК-полимеразы Bacillus subtilisКак известно, бактериальная РНКП представляет собой мультисубъединичныйфермент, состоящий из четырех основных субъединиц – β (~ 133,7 кДа. rpoB), β' (~ 134,3кДа, rpoC) и двух α (~ 34,8 кДа, rpoA), образующих кор-фермент, способный к элонгациитранскрипции [130]. За узнавание промоторов ДНК и инициацию транскрипции отвечаетотдельный фактор σ, который, связываясь с кор-ферментом РНКП, образует такназываемыйхолофермент.Основнымσ-факторомB.subtilis,участвующимвтранскрипции большинства генов «домашнего хозяйства» («house-keeping» genes),является σA (~ 43 кДа, sigA), – гомолог фактора σ70 E. coli. Нами были опробованы триразличные методики выделения кор-фермента и холофермента РНКП.
Две из них описаныв работах [131] и [132], третья – разработана в сотрудничестве с лабораторией проф.М. Салас (Центр молекулярной биологии имени С. Очоа, Автономный УниверситетМадрида, Испания). Кроме того, было проведено отдельное выделение σ A-субъединицыРНКП [131].Основным преимуществом первой методики [131] являлась возможность выделенияне только кор-фермента РНКП, содержащего субъединицы ααββ', но и двух другихвариантов кор-РНКП, в составе которых содержались малые субъединицы ω1 (~ 8,3 кДа,ykzG) или ω2 (~ 7,8 кДа, yloH/rpoZ)15. Культуры клеток E.
coli, трансформированныесоответствующимиплазмидами,выращиваливприсутствииампициллинаилиампициллина и хлорамфеникола (см. главу «Экспериментальная часть»). Экспрессиюцелевогобелкаиндуцировалиспомощьюдобавленияизопропил-1-тио-β-D-галактопиранозида (ИПТГ). Все варианты кор-РНКП содержали гексагистидиновыепоследовательности на С-конце β'-субъединицы и были последовательно очищены спомощью аффинной хроматографии на колонке HiTrap (GE Healthcare, Щвейцария) сNi2+-сефарозой и ионообменной ВЭЖХ на колонке MonoQ Методика 1 в главе«Экспериментальная часть»).
Выделение σA-фактора, содержащего на С-конце блок изшести остатков гистидина (σAHIS), проводили аналогично, причем первой стадии очисткибыло достаточно для получения практически гомогенного препарата (рис. II.3). Фракциибелков анализировали с помощью гель-электрофореза по Лэммли. Как видно из рис.
II.3,гомогенность полученных препаратов кор-РНКП, в отличие от σA, была чрезвычайнонизка. Все полученные варианты белка после реконструкции холофермента РНКП были15Белок ω выполняет структурную функцию при сборке холофермента РНКП E. coli in vitro и in vivo,взаимодействуя с β'-субъединицей. Субъединица ω2 РНКП B. subtilis гомологична ω-субъединицеРНКП E. coli, а также белкам RpoK архей и RPB6 эукариот, участвующим в сборке соответствующих РНКП.Субъединица ω1 РНКП B. subtilis характеризуется низкой степенью гомологии с перечисленными белками иеё локализация в составе холофермента РНКП, по-видимому, отличается от субъединицы ω2 [133].68неактивны в экспериментах по транскрипции in vitro, что привело к отказу от даннойметодики.Отметим, что еще одной малой субъединицей в составе кор-фермента РНКПявляется белок δ (~ 20,4 кДа, rpoE). Его функция, также как и функции субъединиц ω1 иω2, до конца не изучены.
Отсутствие δ-субъединицы в составе холофермента РНКПсущественно влияет на специфичность узнавания промоторов и сродство фермента ксинтезированной de novo мРНК [134]. С этой точки зрения основным недостаткомбольшинства методик выделения гомогенного препарата РНКП B. subtilis являетсямногостадийная очистка фермента, в процессе которой малые субъединицы «теряются».Кроме того, нельзя исключить влияние на функционирование РНКП дополнительныхфакторов белковой природы, ассоциированных с ферментом. Поскольку в работепланировалось изучить влияние 6S РНК B. subtilis на транскрипцию генов in vitro, аспецифика взаимодействий 6S РНК B. subtilis с РНКП в зависимости от субъединичногосостава фермента не была известна, было принято решение упростить методикувыделения белка с целью получения максимально активного фермента.Рис.
II.3. Анализ гомогенности препаратов РНКП (А) и σA* (Б) методом электрофореза в15%-ном ДСН-ПААГ (окрашивание кумасси G-250). М: набор белков-маркеров молекулярноймассы, кДа (указаны слева).* Подвижность в геле субъединицы σA не соответствует рассчитанной молекулярной массе (~ 44 кДа).Подобное поведение белка при гель-электрофорезе является его характерной особенностью, вероятно, из-заналичия протяженных положительно и отрицательно заряженных аминокислотных кластеров [135].В Методике 2 (глава «Экспериментальная часть») использовали клетки B. subtilisштамма МН5636, геном которых содержит на 3'-конце гена rpoC дополнительнуюнуклеотидную последовательность, кодирующую 10 остатков гистидина [136].
B. subtilisМН5636 является производным широко используемого штамма JH642 и не имеетустойчивости к антибиотикам. Экспрессия всех субъединиц белка происходит с ихприродных промоторов без дополнительного воздействия. Выделение холоферментаРНКП проводили в одну стадию методом аффинной хроматографии Ni2+-NTA-агарозе.Фракции,собранныевпроцессевыделения,анализировалиметодомгель-69электрофореза (рис. II.4).
Сравнение молекулярных масс наиболее интенсивных зон срасположением зон белков-маркеров молекулярной массы, позволяет утверждать оналичии всех основных субъединиц16 РНКП в выделенном белке: α ~ 34 кДа, β ~ 134 кДа,β'HIS ~ 136 кДа, σA ~ 43 кДа (рис. II.4, дорожка 3).Следуя данной методике, из 1 л клеточной культуры можно выделить ~ 190 мкгбелка. Концентрацию полученного препарата РНКП определяли методом Брэдфорд. Онасоставила ~ 0,7 мкг/мкл или ~ 1,75 мкМ (молекулярная масса холофермента РНКП сучетом малых субъединиц ω и δ составляет ~ 400 кДа). Выделенная РНКПдемонстрировала высокую процессивность в реакции транскрипции in vitro (рис. II.5).Ранее была описана возможность использования РНКП низкой степени очистки(выделенной только с помощью аффинной хроматографии) для изучения транскрипциигенов [137].Рис.
II.4. Электрофоретический анализ в15%-ном ДСН-ПААГ гомогенности препаратовхолофермента РНКП (~ 4 мкг), выделенных поМетодике 2 (дорожка 3) и Методике 3(дорожка 4). Дорожка 2 – препарат белка σAB. subtilis, предоставленный проф. М. Салас.Дорожка 1 – набор белков-маркеровмолекулярной массы, кДа (указаны слева).Фотографиягеляпослеокрашиванияраствором кумасси G-250.Для выяснения механизма взаимодействия 6S РНК и РНКП B.
subtilis требовалсяболее гомогенный препарат фермента. Был разработан специальный многостадийныйпротокол выделения нативного белка РНКП B. subtilis из клеток штамма 110NA(Методика 3 в главе «Экспериментальная часть»). Экспрессия всех субъединиц ферментапроисходила с их природных промоторов без дополнительной индукции.Первая стадия выделения РНКП из клеточного лизата заключалась в осаждениибелков и ДНК в буфере, содержащем 9% (m/V) ПЭГ-6000 и 1,7% (m/V) декстрана-500, азатем в частичном растворении осажденных белков при добавлении NaCl доконцентрации 1,5 М.
При повышении концентрации NaCl до 4 М белковая фракция,содержащая РНКП, переходила в раствор. Часть примесных белков затем осаждали16Предполагаемые субъединицы РНКП были извлечены из соответствующих зон геля и подвергнутыпротеолизу трипсином. Последующий анализ методом масс-спектрометрии MALDI-TOF подтвердил ихсоответствие субъединицам РНКП B. subtilis β, α и σA.70добавлением (NH4)2SO4 до концентрации 33% (m/V), что также приводило к разделениюфаз и избавлению от ПЭГ.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
