Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Дорожки 2 и 3 – транскрипция в присутствии [γ-32P]GTP и [γ-32P]АTP,соответственно. Дорожки 4, 5 и 6 – транскрипция в присутствии [α-32P]GTP, [α-32P]СTP и[α-32P]UTP, соответственно. Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S РНК; 200 мкМ 4×NTP. Радиоавтографы25%-ных ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях (7 М мочевина). Справауказаны установленные нуклеотидные последовательности пРНК.
Нуклеотиды, положениекоторых было определено по результатам эксперимента, выделены цветом, соответствующимцвету того или иного [α-32P]- или [γ-32P]NTP.19Как правило, транскрипция в клетках B. subtilis начинается с остатка A или G. Для проверки возможностистарта транскрипции с остатков U и С, аналогичные эксперименты проводили в присутствии [β-32P]UTP и[β-32P]СTP. В обоих случаях синтез [32P]-меченных продуктов транскрипции не был зафиксирован (как для6S-1 РНК, так и для 6S-2 РНК, данные не приведены).85ДляустановлениянуклеотидныхпоследовательностейпРНКтранскрипциюпроводили также в присутствии различных [α-32P]-меченных нуклеозидтрифосфатов, приэтом длина первого из детектируемых транскриптов указывалана положениевстраиваемого нуклеотида в цепи полноразмерной пРНК.
Например, при использовании[α-32P]СTP первый детектируемый продукт транскрипции с 6S-1 РНК представляет собой4-звенный олигорибонуклеотид (рис. II.16А, дорожка 7). Cледовательно, первый остатокС, который встречается в последовательности пРНК6S-1, является четвертым по счетунуклеотидом. В случае пРНК6S-2 первый остаток С расположен в позиции 12, так как приавторадиографии детектируются только транскрипты, длина которых составляет 12 иболее н.о. (рис.
II.16Б, дорожка 5). Аналогичное соотнесение было проведено для остатковG и U. Незначительные трудности возникли при определении положения первого по счетуостатка А в последовательности пРНК6S-1, поскольку при использовании [α-32P]АTPпоявлялсянеспецифическийсигнал,соответствующий~ 5-звенномупродуктутранскрипции. Тем не менее наиболее интенсивным из первых детектируемых продуктовспецифической транскрипции в присутствии [α-32P]АTP являлся 9-звенный вариантпРНК6S-1.Косвеннополученныйрезультатподтверждаетсяэкспериментамипотранскрипции в отсутствие АТР (рис. II.16А, дорожки 8 и 9). В этом случае транскрипцияостанавливалась, главным образом, после каталитического присоединения 9-го и частичнопосле 10-го нуклеотидов в цепи пРНК.
Известно, что РНКП обладает способностьюнеспецифически добавлять 1-2 н.о. с 3'-конца синтезирующейся РНК в отсутствиенеобходимого субстрата20. Так как после 9-го остатка А в последовательности пРНКследуют еще три остатка аденозина, вероятность для РНКП «проскочить» такой участок ипродолжить синтез комплементарной РНК крайне мала, поэтому происходит терминациятранскрипции.Таким образом в результате проведенных экспериментов были определены позициипервых с 5'-конца остатков А, U, G и С в последовательностях пРНК6S-1 и пРНК6S-2.
Вобоих случаях только один комплементарный участок в каждой из 6S РНК соответствовалтакому расположению нуклеотидов относительно друг друга. Транскрипция обеих пРНКначиналась внутри центральной петли и продолжалась в сторону 5'-конца 6S-1 или6S-2 РНК (рис. II.17), аналогично тому, как это обнаружено для 6S РНК E. coli. Интересно,что нуклеотидные последовательности пРНК6S-1 и пРНК6S-2 содержат два идентичныхучастках 5'-GGU-3' и 5'-AAAACU-3', разделенных одним н.о.20В условиях in vivo добавление некомплементарного ДНК-матрице нуклеотида с 3'-концасинтезирующейся цепи РНК приводит к остановке транскрипции. Процесс восстанавливается с помощьюфакторов элонгации Gre, удаляющих некомплементарный нуклеотид [144].86Рис.
II.17. Нуклеотидные последовательности и относительное расположение пРНК,синтезируемых РНКП с 6S РНК E. coli и 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis. Стартовые точкитранскрипции отмечены тонкими стрелками, направление синтеза пРНК – прерывистой линией сострелкой. Гомологичные участки пРНК6S-1 и пРНК6S-2 подчеркнуты.Для подтверждения состава установленных нуклеотидных последовательностейпРНК продукты транскрипции in vitro с 6S-1 и 6S-2 РНК анализировали методом блотгибридизации в варианте Нозерн, используя в качестве зондов к пРНК6S-1 и пРНК6S-2синтетическиеолигодезоксирибонуклеотидызаданнойпервичнойструктурысвключениями остатков ковалентно замкнутых нуклеозидов (LNA, «locked nucleic acid»).Введение остатков LNA в состав олигонуклеотида существенно повышает стабильностьобразующихся в результате гибридизации ДНК-пРНК дуплексов21, что позволяет свысокой чувствительностью детектировать короткие олигорибонуклеотиды длинойпорядка 10 н.о.
[145]. Для последующей иммунодетекции к 5'-концу синтетических зондовковалентно присоединяли остаток дигоксигенина (DIG) (рис. II.18). В качествеположительных контролей использовали синтетические олигорибонуклеотиды длиной 14н.о. (p146S-1) и 12 н.о. (p126S-2), идентичные определенным последовательностям пРНК6S-121Метиленовый мостик, соединяющий 2'-О и 4'-С атомы рибозы в бициклических аналогах нуклеозидовобеспечивает стабильную β-D-конформацию сахара.87и пРНК6S-2 (см. табл.
III.9 в главе «Экспериментальная часть»). Как видно из рис. II.18,продуктытранскрипциисобеих6S РНКспецифическигибридизовалисьссинтетическими зондами, что доказывает правильность установленных нуклеотидныхпоследовательностей пРНК6S-1 и пРНК6S-2.Рис. II.18. Результаты блот-гибридизации продуктов транскрипции (Ф. к.: 1 мкМ РНКП;1 мкМ 6S РНК; 200 мкМ 4×NTP) с 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis (дорожки 5 и 6, соответственно).Дорожки 1-2 и 3-4 – синтетические олигорибонуклеотиды, аналоги пРНК6S-1 и пРНК6S-2,соответственно, длиной 14 н.о.
и 12 н.о. (положительные контроли). Последовательности зондов,используемых для гибридизации, указаны справа. Остатки ковалентно замкнутых нуклеозидоввыделены жирным шрифтом и курсивом и подчеркнуты. DIG – остаток дигоксигенина.Непосредственно синтез пРНК на матрице 6S РНК не является функциональнозначимым для процесса ингибирования транскрипции. Главным свойством пРНК являетсяспособность к образованию комплекса с 6S РНК и последующая потеря сродства такогокомплексакформированияРНКП.Следовательно,комплексов6SнеобходимоРНК:пРНК.Длябылоэтогопоказатьизучаливозможностьвзаимодействие5'-[32P]-меченных 6S РНК с РНКП в присутствии смеси нуклеозидтрифосфатов.
Продуктыреакции анализировали методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях(рис. II.19). Для предотвращения неспецифических взаимодействий 6S РНК и РНКП вреакционную смесь добавляли гепарин (40 нг/мкл). В отсутствие нуклеозидтрифосфатовдетектировались только комплексы 6S РНК:РНКП и «свободные» 6S РНК (рис. II.19А, Б,дорожки 1). При добавлении четырех NTP (200 мкМ каждого) как в случае 6S-1 РНК22,так и в случае 6S-2 РНК, наблюдали появление дополнительной радиоактивной зоны,характеризующейся меньшей подвижностью в геле по сравнению со «свободными»6S РНК (рис. II.19А, Б, дорожки 2-7).
Для корректного соотнесения радиоактивных зон вкачествеположительныхконтролейиспользовалипредварительнообразованные22Эксперимент с 6S-1 РНК проводился асп. Ф. Хохом под руков. проф. Р. Хартманна (Институтфармацевтической химии, Марбургский университет имени Филиппа, Германия) и опубликован ранее вработе [146].
Радиоавтограф геля (рис. II.19А) размещен с разрешения Ф. Хоха и Р. Хартманна длясравнительного анализа 6S-1 и 6S-2 РНК.88комплексы 6S-1 и 6S-2 РНК с синтетическими олигорибонуклеотидами – аналогами пРНКдлиной 14 н.о. (р146S-1) и 15 н.о. (р156S-2), соответственно. Вероятность образованиядуплекса между пРНК и 6S РНК в растворе довольно мала в отличие от ситуации, когдаРНКП синтезирует пРНК непосредственно на матрице 6S РНК. Поэтому дляформирования «искусственного» комплекса вначале разрушали вторичную структуру6S РНК, нагревая реакционную смесь до 95°С, а затем проводили её ренатурацию вприсутствии избытка соответствующего олигорибонуклеотида, ступенчато охлаждаяреакционную смесь до 37°С. Скорость миграции «искусственно» полученных комплексов6S РНК:пРНК (рис.
II.19А, дорожка 10; рис. II.19Б, дорожка 9) соответствовала скоростимиграции комплексов, образующихся при транскрипции пРНК на 6S РНК. Таким образомв результате транскрипции как с 6S-1 РНК, так и с 6S-2 РНК, синтезированныепРНК-транскрипты остаются связанными с соответствующими 6S РНК, образуя комплекс6S РНК:пРНК.Рис. II.19. Анализ комплексообразования 5'-[32P]-меченных 6S-1 РНК (А) и 6S-2 РНК (Б) схолоферментом РНКП в присутствии четырех нуклеозидтрифосфатов (200 мкМ). (А) Дорожки 1 и8 – комплексообразование РНКП (2 мкМ) с 6S-1 РНК (1 мкМ) в отсутствие NTP после инкубациипри 37°С в течение 30 мин и 180 мин, соответственно. Дорожки 2-7 – комплексообразованиеРНКП (2 мкМ) с 6S-1 РНК (1 мкМ) в присутствии 4×NTP после инкубации при 37°С в течение10-180 мин. Дорожка 9 – исходная 6S-1 РНК.
Дорожка 10 – комплекс 5'-[32P]-меченной6S-1 РНК (1 мкМ) с синтетическим аналогом пРНК6S-1 (10 мкМ) длиной 14 н.о. (р146S-1) [146].(Б) Дорожка 1 – комплексообразование РНКП (2 мкМ) с 6S-2 РНК (1 мкМ) в отсутствие NTPпосле инкубации при 37°С в течение 30 мин. Дорожки 2-7 – комплексообразование РНКП (2 мкМ)с 6S-2 РНК (1 мкМ) в присутствии 4×NTP после инкубации при 37°С в течение 10-180 мин.Дорожка 8 – исходная 6S-2 РНК. Дорожка 9 – комплекс 6S-2 РНК (1 мкМ) с 5'-[32P]-меченнымсинтетическим аналогом пРНК6S-2 (1 мкМ) длиной 15 н.о. (р156S-2). Радиоавтографы 7,5%-ныхПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях.Как видно из рис.
II.19, через 180 мин после начала транскрипции большая часть«свободной» 6S-1/6S-2 РНК оказывается в комплексе с пРНК (рис. II.19А, Б, дорожки 7), вто же время степень связывания 6S РНК с РНКП немного уменьшается и составляет~ 80% по сравнению с исходной степенью связывания до добавления NTP (рис. II.19А, Б,дорожки 1). Это свидетельствует о частичном высвобождении РНКП из комплекса с 6S-1или 6S-2 РНК после синтеза пРНК. На основании полученных результатов можно сделать89вывод, что принцип взаимодействия РНКП с обеими 6S РНК B. subtilis одинаков, исоответствует существующей на данный момент теоретической модели, разработаннойдля системы E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
