Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Поскольку синтез20-звенных пРНК6S-1 при транскрипции с 6S-1 РНК не был зафиксирован, свойствапРНК6S-1 длиной 20 н.о. рассматриваются только для характеристики эффективностиформирования комплексов 6S-1 РНК с олигорибонуклеотидами различной длины.Полученные в этом случае результаты не могут быть экстраполированы на ситуациюin vivo.На следующем этапе исследования было проверена возможность взаимодействияпредварительно сформированных дуплексов 6S РНК:пРНК с РНКП. В первую очередьбыли протестированы дуплексы 5'-[32P]-меченной 6S-1 РНК с синтетическими 12-, 13-, 14и 20-звенными пРНК6S-1 (рис.
II.25). Было показано, что образование дуплекса6S-1 РНК:р146S-1практическиполностьюпредотвращаетсвязываниеРНКПс6S-1 РНК (рис. II.25, дорожка 3). Выход комплекса 6S-1 РНК:РНКП в данном случае94составляет меньше 3%. В то же время более короткие пРНК6S-1 (12 и 13 н.о.) не способныпрепятствовать образованию комплекса 6S-1 РНК:РНКП с той же эффективностью(рис. II.25, дорожки 4-5). Однако это связано с тем, что даже при 10-кратном избытке этихолигорибонуклеотидов не удалось добиться их 100%-ного связывания с 6S-1 РНК собразованием дуплексов (рис.
II.25, дорожки 9-10). По-видимому, в данном случае придобавлении РНКП фермент связывал свободную 6S-1 РНК.Рис. II.25. Анализ взаимодействия РНКП с предварительно сформированными дуплексамимежду 6S-1 РНК и синтетическими пРНК длиной 12, 13, 14 и 20 н.о. (р126S-1, р136S-1, р146S-1 ир206S-1, соответственно). Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S РНК; 10 мкМ синтетической пРНК;100 нг/мкл гепарина. Некомплементарный для 6S-1 РНК олигорибонуклеотид (р156S-2) выделенсерым цветом. Дорожки 1, 7, 12 и 16 – исходная 5'-[32P]-меченная 6S-1 РНК. Дорожки 2 и 13 –комплексообразование РНКП с 5'-[32P]-меченной 6S РНК в отсутствие пРНК (рN6S-1).Дорожки 3-6 и 14 – комплексообразование РНКП с предварительно сформированнымидуплексами между 5'-[32P]-меченной 6S-1 РНК и синтетическими пРНК длиной 14, 13, 12, 15 и20 н.о., соответственно. Дорожки 8-11 и 15 – формирование дуплексов между 5'-[32P]-меченной6S-1 РНК и синтетическими пРНК длиной 14, 13, 12, 15 н.о.
и 20 н.о., соответственно.Дорожка 17 – дуплекс 6S-1 РНК с 5'-[32P]-меченной р146S-1. Дорожка 18 – комплексообразованиеРНКП с предварительно сформированным дуплексом между 6S-1 РНК и 5'-[32P]-меченной р146S-1.Дорожка 19 – комплексообразование РНКП с 5'-[32P]-меченной р146S-1 (отрицательный контроль).6S-1 РНК* неспецифические продукты ренатурации 6S-1 РНК (альтернативные конформации).пРНК* неспецифические сигналы 5'-[32P]-меченной синтетической пРНК р146S-1, вероятно,являющиеся продуктами агрегации олигорибонуклеотида в растворе.
Радиоавтограф 7,5%-ногоПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях.Интересно, что с увеличением длины пРНК на каждый 1 н.о. (от 12 до 14 н.о.)скорость миграции дуплекса 6S-1 РНК:пРНК возрастала (рис. II.25, дорожки 3-5 и 8-10).Это, вероятно, свидетельствует о ступенчатом изменении конформации 6S-1 РНК придобавлении РНК-полимеразой каждого нового нуклеотида к синтезирующейся пРНК.В контрольном эксперименте было продемонстрировано, что некомплементарная 6S-1РНК 15-звенная пРНК6S-2 не только не способна образовывать дуплекс с 6S-1 РНК, но ипрепятствовать формированию комплекса 6S-1 РНК:РНКП (рис.
II.25, дорожки 6, 11).Добавим, что 20-звенная пРНК6S-1, как и пРНК6S-1 длиной 14 н.о., образует стабильный95комплекс с 6S-1 РНК, который полностью теряет сродство к РНКП (рис. 10, дорожки14-15). Таким образом, было установлено, что только пРНК6S-1 длиной не менее 14 н.о.,образуя комплекс с 6S-1 РНК, полностью предотвращают его связывание с РНКП. Дляподтверждения полученного результата, идентичные эксперименты были проведены ссинтетической 14-звенной пРНК6S-1, содержащей радиоактивную32Р-метку (рис. II.25,дорожки 17-19). При авторадиографии детектировался только комплекс 6S-1 РНК:пРНК,тогда как никаких комплексов с РНКП зафиксировано не было.Аналогичные эксперименты были проведены и для 6S-2 РНК. Несмотря напрактически 100%-ную эффективность связывания 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК с15-звенной пРНК6S-2 (р156S-2) РНКП способна образовывать комплекс с 6S-2 РНК сэффективностью до ~ 30% (рис.
II.26А, дорожка 3).Рис. II.26. Анализ взаимодействия РНКП с предварительно сформированными дуплексамимежду 6S-2 РНК и синтетическими пРНК различной длины. Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкм 6S РНК;10 мкМ синтетической пРНК; 100 нг/мкл гепарина. (А) Комплексообразование РНКП спредварительно сформированным дуплексом между 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК и 15-звеннойпРНК6S-2 (р156S-2, дорожка 3).
Дорожки 1 и 7 – исходная 5'-[32P]-меченная 6S-2 РНК. Дорожка 2 –комплексообразование РНКП с 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК в отсутствие пРНК. Дорожки 4 и 6 –формирование дуплексов между 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК и, соответственно, р156S-2 или р146S-1(некомплементарный для 6S-2РНК олигорибонуклеотид, выделен серым цветом). Дорожка 5 –комплексообразование РНКП с 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК в присутствии р146S-1. Дорожка 8 –формирование дуплекса между 6S-2 РНК и 5'-[32P]-меченной 15-звенной пРНК6S-2. Дорожка 9 –комплексообразование РНКП с предварительно сформированным дуплексом между 6S-2 РНК и5'-[32P]-меченной 15-звенной пРНК6S-2. Дорожка 10 – комплексообразование РНКП с5'-[32P]-меченной 15-звенной пРНК6S-2 (отрицательный контроль).
пРНК* неспецифическиесигналы 5'-[32P]-меченных синтетических пРНК, вероятно, являющиеся продуктами агрегацииолигорибонуклеотида в растворе. (Б) Комплексообразование РНКП с предварительносформированными дуплексами между 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК и 16-звенной пРНК6S-2 (р156S-2,дорожка 3) или 20-звенной пРНК6S-2 (р206S-2, дорожка 7).
Дорожки 1 и 5 – 5'-[32P]-меченная6S-2 РНК (отрицательный контроль). Дорожки 2 и 6 – комплексообразование РНКП с 5'-[32P]меченной 6S-2 РНК в отсутствие пРНК. Дорожки 4 и 8 – формирование дуплексов между 5'-[32P]меченной 6S-2 РНК и, соответственно, р166S-2 или р206S-1. Радиоавтографы 7%-ных ПААГ послеэлектрофореза в неденатурирующих условиях.96Такой результат можно было бы объяснить способностью РНКП связывать дуплекс6S-2 РНК:р156S-2.Однаковконтрольныхэкспериментахприиспользовании325'-[ P]-меченной 15-звенной пРНК6S-2 «тройной» комплекс РНКП:6S-2 РНК:р156S-2 недетектировался (рис.
II.26A, дорожка 9). Альтернативным объяснением может бытьнестабильность дуплекса 6S-2 РНК:р156S-2 и его частичная диссоциация в присутствииРНКП. «Высвободившаяся» 6S-2 РНК при этом беспрепятственно взаимодействует сРНКП. Можно предположить, что связывание с 15-звенной пРНК6S-2 не изменяетдолжным образом конформацию 6S-2 РНК, и фермент по-прежнему способен узнаватьтакой субстрат. Вероятно, взаимодействие РНКП с дуплексом 6S-2 РНК:р156S-2 приводитк немедленной диссоциации пРНК, поэтому «тройной» комплекс РНКП:6S-2 РНК:р156S-2в условиях эксперимента не детектируется. Увеличение длины пРНК 6S-2 до 16 н.о. такжене привело к существенному изменению её свойств (рис.
II.26Б, дорожка 3). Несмотря наотсутствие свободной 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК вследствие её 100%-ного связывания с16-звенной пРНК6S-2, комплекс 6S-2 РНК:РНКП по-прежнему детектировался приавторадиографии. То есть фермент «конкурентно» вытеснял пРНК. Предотвратить этотпроцесс удалось только при использовании 20-звенного олигорибонуклеотида аналогапРНК6S-2.
Несмотря на идентичную скорость миграции дуплекса 6S-2 РНК:р206S-2 посравнению с дуплексами, образованными более короткими олигорибонуклеотидами, он неподвергался диссоциации в присутствии РНКП и практически полностью предотвращалвзаимодействие фермента с 6S-2 РНК (рис. II.26Б, дорожка 7).Таким образом, теоретические данные о близких значениях G° образованиядуплексов между 14-звенной пРНК6S-1 и 6S-1 РНК и между 20-звенной пРНК6S-2 и6S-2 РНК (рис. II.23) были подтверждены экспериментально. Однако, исходя только изэкспериментов по комплексообразованию, нельзя однозначно утверждать, что данныедуплексы стабильны при добавлении РНКП и не диссоциируют, высвобождая 6S РНК.Крометого,былонеобходимопроверитьфункциональностькомплексов«высвободившейся» 6S РНК с ферментом при использовании более короткихолигорибонуклеотидов.Основнымкритериемфункциональностикомплекса6S РНК:РНКП является синтез пРНК de novo.
Схема предложенного нами экспериментапредставлена на рис II.27А. Предварительно сформированные дуплексы 6S РНК ссинтетическими пРНК разной длины инкубировали с РНКП, а затем добавляли смесьнуклеозидтрифосфатов, содержащую [α-32P]UTP (в случае 6S-1 РНК) или [α-32P]АTP (вслучае 6S-2 РНК).97Рис. II.27. Транскрипция de novo пРНК в присутствии предварительно сформированныхкомплексов 6S-1 и 6S-2 РНК с синтетическими пРНК разной длины. Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ6S РНК; 10 мкМ синтетическая пРНК; 100 нг/мкл гепарина; 200 мкМ 4×NTP, 0,5 мкКи [α-32P]UTP(в случае 6S-1 РНК) или [α-32P]-АTP (в случае 6S-2 РНК).
(А) Схема эксперимента.(Б) Транскрипция de novo пРНК в присутствии комплексов 6S-2 РНК с синтетическими пРНКразличной длины. Дорожка 1 – реакционная смесь в отсутствие 6S РНК (отрицательныйконтроль). Дорожки 2 и 3 – маркеры длины РНК (M-20 и М-15), 5'-[32P]-меченныеолигорибонуклеотиды p206S-2 и р156S-2, соответственно. Дорожка 4 – транскрипция de novo пРНК сматрицы 6S-2 РНК в отсутствие синтетических пРНК (рN6S-2). Дорожки 5-10 – транскрипцияde novo пРНК в присутствии предварительно сформированных комплексов 6S-2 РНК ссинтетическими пРНК6S-2 длиной 20, 16, 15, 14, 13 и 12 н.о., соответственно.
Дорожка 11 –транскрипция de novo пРНК с матрицы 6S-2 РНК в присутствии некомплементарной пРНК6S-1длиной 14 н.о. (р146S-1). (В) Транскрипция de novo пРНК в присутствии комплексов 6S-1 РНК ссинтетическими пРНК различной длины. Дорожка 1 – реакционная смесь в отсутствие 6S РНК(отрицательный контроль). Дорожки 2 и 8 – маркеры длины РНК (М-14 и М-8), 5'-[32P]-меченныеолигорибонуклеотиды p146S-1 и р86S-1, соответственно. Дорожка 3 – транскрипция de novo пРНК сматрицы 6S-1 РНК в отсутствие синтетических пРНК (рN6S-1). Дорожки 4-6 – транскрипцияde novo пРНК в присутствии предварительно сформированных дуплексов между 6S-1 РНК исинтетическими пРНК6S-1 длиной 14, 13 и 12 н.о., соответственно.
Дорожка 7 – транскрипцияde novo пРНК с матрицы 6S-1 РНК в присутствии некомплементарной пРНК6S-2 длиной 15 н.о.(р156S-2). Появление «шлейфов» в дорожках 3 и 7 связано с неполной денатурацией реакционнойсмеси перед нанесением в гель. Радиоавтографы 25%-ных ПААГ после электрофореза вденатурирующих условиях (7 М мочевина).98Если комплекс 6S РНК:пРНК был достаточно стабилен и не диссоциировал,высвобождая 6S РНК, то даже в случае слабого неспецифического взаимодействия РНКПс таким комплексом фермент не мог вести транскрипцию. Наоборот, в случае даженезначительной диссоциации РНКП могла использовать высвободившуюся 6S РНК какматрицу для транскрипции пРНК de novo. Кроме того, такой эксперимент мог исключитьили подтвердить возможность специфического взаимодействия комплексов 6S РНК:пРНКс РНКП, поскольку в таком случае фермент мог либо достраивать синтетическиеолигорибонуклеотиды до определенной длины, либо синтезировать пРНК, начиная сальтернативной стартовой точки транскрипции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
