Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 19
Текст из файла (страница 19)
coli (раздел I.2.2.3 в главе «Обзор литературы»).Анализ комплексобразования РНКП с 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК через короткоевремя (1-5 мин) после начала инкубации с нуклеозидтрифосфатами позволил выявитьинтересный факт. На начальных этапах синтеза пРНК образование комплекса6S-2 РНК:пРНК6S-2 приводит к уменьшению фракции комплекса 6S-2 РНК:РНКП до 20%по сравнению с исходной (рис. II.20А, дорожка 3), однако после 10 мин от началатранскрипции степень связывания 6S-2 РНК с РНКП вновь начинает увеличиваться до~ 40% от исходной (рис. II.20А, дорожка 6).Рис. II.20.
Анализ комплексообразования 5'-[32P]-меченной 6S-2 РНК с холоферментомРНКП в присутствии 4×NTP (200 мкМ) после 1-10 мин от начала синтеза пРНК.(А) Радиоавтограф 5%-ного ПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях.Дорожка 1 – исходная 6S-2 РНК, дорожка 2 – комплексообразование РНКП (2 мкМ) с6S-2 РНК (1 мкМ) в отсутствие NTP после инкубации при 37°С в течение 15 мин.
Дорожки 2-6 –комплексообразование РНКП (2 мкМ) с 6S-2 РНК (1 мкМ) в присутствии 200 мкМ 4×NTP послеинкубации при 37°С в течение 1-10 мин. (Б) Диаграмма процентного состава реакционной смеси взависимости от времени инкубациис NTP. (В) Схематичное представление эксперимента.Результатыколичественногоанализаотносительныхинтенсивностейрадиоактивности «свободной» 6S-2 РНК и её комплексов с пРНК и РНКП приведены нарис.
II.20Б. Полученные результаты могут быть объяснены низкой стабильностьюкомплексов 6S-2 РНК с синтезируемыми de novo пРНК. В присутствии смесинуклеозидтрифосфатов РНКП в комплексе с 6S-2 РНК начинает синтезировать пРНК, чтоприводит к эффективному высвобождению фермента (время инкубации < 1 мин). Однако90большая часть образующихся дуплексов 6S-2 РНК:пРНК диссоцирует в растворе исвободная 6S-2 РНК вновь связывается с РНКП, затем цикл повторяется и доля дуплексов6S-2 РНК:пРНК постепенно увеличивается (рис. II.20В). Это объясняет низкуюэффективность (менее 20%) вытеснения РНКП из комплекса с 6S РНК в аналогичныхэкспериментах в условиях длительной (в течение 3 ч) инкубации реакционной смеси с4×NTP (рис.
II.19). Исследования эффективности комплексообразования РНКП с 6S-1РНК через короткое время после начала инкубации с нуклеозидтрифосфатами непроводились.На следующем этапе работы сравнили эффективности синтеза пРНК 6S-1 и пРНК6S-2.Транскрипцию проводили в присутствии возрастающих количеств 6S РНК, используя вкачестве радиоактивной метки [α-32P]UTP для 6S-1 РНК и [α-32P]АTP для 6S-2 РНК. Этопозволяло в обоих случаях после электрофореза в 25%-ном ПААГ в денатурирующихусловиях детектировать транскрипты длиной от 2 н.о. (рис. II.21). Отметим, что в случае6S-1 РНК наблюдали появление незначительного количества 15- и 16-звенных пРНК,однако превалирующим транскриптом являлась пРНК длиной 14 н.о.Рис. II.21.
Анализ продуктов транскрипции – пРНК6S-1 и пРНК6S-2 – в присутствиивозрастающих количеств 6S-1 и 6S-2 РНК. Дорожки 1 и 16 – транскрипционные смеси вотсутствие 6S РНК (отрицательные контроли). Дорожки 2, 8 и 9, 15 – маркеры длин РНК,5'-[32P]-меченные синтетические олигорибонуклеотиды – аналоги пРНК6S-1 и пРНК6S-2, длиной13 н.о. (р136S-1), 14 н.о. (р146S-1), 15 н.о. (р156S-2), и 12 н.о. (р126S-2). Дорожки 3-7 и 10-14 –транскрипция в присутствии возрастающих количеств 6S-1 РНК и 6S-2 РНК,соотвестственно (0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 5 мкМ).
Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 200 мкМ 4×NTP.Радиоавтографы 25%-ного ПААГ после электрофореза в денатурирующих условиях (7 Ммочевина).91В случае 6S-2 РНК 13-16-звенные пРНК синтезировались со сравнимойэффективностью, а при высоких концентрациях 6S-2 РНК удалось детектироватьобразование и более протяженных продуктов транскрипции длиной до ~ 24 н.о.Наоснованииобсчетаинтенсивностейрадиоактивныхзон,соответствующихтранскриптам длиной 10-16 н.о., с учетом количества потенциально радиоактивныхостатков U или А в последовательности (данные не приведены), был сделан вывод, чтообе пРНК транскрибируются с примерно одинаковой эффективностью.При анализе тех же транскрипционных смесей методом электрофореза в 7%-номПААГ в неденатурирующих условиях, было установлено, что в условиях экспериментапроцент образовавшегося комплекса 6S-2 РНК:пРНК6S-2 по сравнению с комплексом6S-1 РНК:пРНК6S-1 крайне низок, хотя и увеличивается при возрастании концентрации6S-2 РНК (рис.
II.22). Отметим, что радиоактивную метку (остаток [α-32P]U или [α-32P]А)содержали только продукты транскрипции – пРНК и их комплексы с 6S РНК.Рис. II.22. Анализ продуктов транскрипции – пРНК6S-1 и пРНК6S-2 – в присутствиивозрастающих количеств 6S-1 и 6S-2 РНК методом гель-электрофореза в неденатурирующихусловиях. Дорожки 1-5 и 9-13 – транскрипция в присутствии возрастающих количеств,соответственно, 6S-1 РНК и 6S-2 РНК (0,1 мкМ; 0,5 мкМ; 1 мкМ; 2 мкМ; 5 мкМ).
Ф. к: 1 мкМРНКП; 200 мкМ 4×NTP. В качестве радиоактивной метки использовали [α-32P]UTP для 6S-1 РНК и[α-32P]АTP для 6S-2 РНК. Дорожки 6 и 14 – транскрипционные смеси в отсутствие 6S РНК с[α-32P]UTP и [α-32P]АTP, соответственно (отрицательные контроли). Дорожки 7 и 15 –5'-[32P]-меченные 6S-1 и 6S-2 РНК, соответственно. Дорожка 8 – предварительно сформированныйкомплекс 5'-[32P]-меченной 6S-1 РНК (2 мкМ) с синтетической пРНК6S-1 длиной 14 н.о.
(20 мкМ,р146S-1). Дорожка 16 – предварительно сформированный комплекс 5'-[32P]-меченной 6S-2РНК (2 мкМ) с синтетической пРНК6S-2 длиной 15 н.о. (20 мкМ, р156S-2). Радиоавтограф 7%-ногоПААГ после электрофореза.Полученные результаты не согласовались с данными о примерно одинаковыхвыходах de novo синтезированных пРНК6S-1 и пРНК6S-2 (рис. II.21). Однако в ходетранскрипции РНКП синтезирует целый ряд пРНК длиной от 2 до как минимум 14 н.о. вслучае 6S-1 РНК и до 16 н.о. в случае 6S-2 РНК. В системе E. coli было установлено, чтотолько пРНК длиной более 9 н.о.
могут образовывать стабильный комплекс с 6S РНК, асинтез олигорибонуклеотидов длиной более чем 14 н.о. приводит к высвобождениюРНКП из её комплекса с 6S РНК [147]. Очевидно, что стабильность комплексов 6S-1 и6S-2 РНК B. subtilis с соответствующими пРНК разной длины тоже должна быть92различной. Кроме того, из-за отличия нуклеотидных последовательностей эффективностьгибридизации пРНК6S-1 и пРНК6S-2 одинаковой длины с 6S-1 и 6S-2 РНК, соответственно,может существенно различаться.
С помощью программы «RNAcofold» были предсказанывеличины энергии Гиббса (G°) образования дуплексов между пРНК6S-1 и пРНК6S-2различной длины и комплементарными им участками в 6S-1 и 6S-2 РНК (рис. II.23).Оказалось, что лишь 20-звенный вариант пРНК6S-2 может образовывать с 6S-2 РНКдуплекс, сходный по стабильности с дуплексом 14-звенной пРНК6S-1 с 6S-1 РНК, тогда какдуплексы6S-2РНКсболеекороткимипРНК6S-2характеризуютсябольшимизначениями G°. Действительно, нуклеотидная последовательность пРНК6S-2 являетсязначительно более A,U-богатой (~ 85%) по сравнению с пРНК6S-1 (~ 55%), что, вероятно,приводит к низкой стабильности комплексов 6S-2 РНК:пРНК6S-2. То есть подавляющеебольшинство синтезирующихся с матрицы 6S-2 РНК транскриптов, вероятно, не способнооставаться в комплексе с молекулой РНК.Рис.
II.23. Стабильность дуплексов 6S-1 и 6S-2 РНК с соответствующими пРНК различнойдлины. Значения минимальной свободной энергии образования РНК-РНК дуплексов (G°)оценены с помощью программы «RNAcofold» (http://rna.tbi.univie.ac.at) [148].Дляпроверкитеоретическихданных,впервуюочередьбылоизученовзаимодействие 6S-2 РНК с 5'-[32P]-меченными синтетическими пРНК длиной 12-16 н.о. и20 н.о. Эти эксперименты позволили выяснить «критическую» длину пРНК, необходимуюдля образования стабильного комплекса с 6S-2 РНК. Для сравнения аналогичныеэксперименты провели и для 6S-1 РНК, используя пРНК длиной 12-14 и 20 н.о.Формирование дуплексов проводили путем ступенчатого «отжига» двукратного избыткасинтетического олигорибонуклеотида на матрице 6S РНК.Как и ожидалось, эффективность образования дуплексов 6S РНК:пРНК прямопропорционально зависела от длины пРНК, причем комплексы 6S-1 РНК отличалисьбольшей стабильностью по сравнению с комплексами для 6S-2 РНК, формируемымипРНК одинаковой длины (рис.
II.24). Методом «торможения в геле» показано, что 12- и13-звенные пРНК6S-2 практически неспособны образовывать дуплекс с 6S-2 РНК, а с93увеличением длины пРНК степень их связывания с 6S-2 РНК возрастает (рис. II.24Б).Аналогичная тенденция наблюдалась и для пРНК6S-1, причем комплекс 6S-1 РНК снаиболее короткой 12-звенной пРНК6S-1 уже был стабилен и детектировался приавторадиографии (рис.
II.24А).Рис. II.24. Влияние длины синтетических пРНК на стабильность комплексов6S-1 РНК:пРНК (А) и 6S-2 РНК:пРНК (Б). (А) Дорожки 1-4 – образование комплексов6S-1 РНК (1 мкМ) с 5'-[32P]-меченными пРНК6S-1 (2 мкМ) длиной 20, 14, 13 и 12 н.о. (р206S-1,р146S-1, р136S-1 и р126S-1). Дорожка 5 – 5'-[32P]-меченная 6S-1 РНК. 6S-1 РНК* – неспецифическийпродукт ренатурации 6S-1 РНК (выделен серым шрифтом). (Б) Дорожки 1-6 – образованиекомплексов 6S-2 РНК (1 мкМ) с 5'-[32P]-меченными пРНК6S-2 (2 мкМ) длиной 20, 16, 15, 14, 13 и12 н.о.
(р206S-2, р166S-2, р156S-2, р146S-2, р136S-2 и р126S-2). Дорожка 7 – 5'-[32P]-меченная 6S-2 РНК.Радиоавтографы 15%-ных ПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях.Отметим, что комплекс 6S-1 РНК с пРНК6S-1 длиной 20 н.о. отличался более низкойподвижностью в геле по сравнению с комплексами, которые образуют 12-14-звенныепРНК6S-1 (рис. II.24А, дорожка 1). Вероятно, помимо большей молекулярной массы такойкомплексхарактеризуетсячрезвычайновысокойстабильностьюиспособствуетобразовыванию альтернативной конформации 6S-1 РНК, принципиально отличающейсяот конформаций молекулы в комплексе с 14-, 13- и 12-звенными пРНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
