Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 16
Текст из файла (страница 16)
II.9А-Г). Добавление гепарина,неспецифически взаимодействующего с РНКП, в концентрации 50-100 нг/мкл лишьнезначительно снижало уровень транскрипции (рис. II.9Д), а дальнейшее повышение егоколичества в реакционной смеси практически не влияло на выход транскрипта. Поэтомувсе дальнейшие эксперименты по транскрипции in vitro проводили при концентрациигепарина 100 нг/мкл.
Предварительное «насыщение» холофермента РНКП избыткамиσA-фактора приводило к повышению активности фермента всего лишь на 15% (рис. II.9Е),что свидетельствует о высокой активности исходного препарата полимеразы. В связи сэтим в экспериментах было решено использовать РНКП без дополнительногодобавления σA.18Понижение концентрации UTP относительно трех других NTP увеличивает эффективность встраивания вситнезируемую цепь РНК остатка [α-32P]U при использовании [α-32P]UTP.75Рис. II.9.
Подбор оптимальных условий транскрипции in vitro с промотора гена rrnB.Финальная концентрация (ф. к.): 100 нМ РНКП, 100 нМ ДНК, 5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого изATP, CTP, GTP, 50 мкМ UTP, 0,5 мкКи [α-32P]UTP, 100 нг/мкл гепарина (если не указано иное).(А) Зависимость эффективности транскрипции от концентрации ДНК-матрицы.
Дорожки 1 и 8 –маркер длины РНК (192 н.о., 5'-[32P]-меченная 6S-1 РНК), дорожка 9 – транскрипция в отсутствиеДНК (отрицательный контроль). Дорожки 2-7 – транскрипция при возрастающих концентрацияхДНК (10-300 нМ). Радиоавтограф 5%-ного ПААГ после электрофореза в денатурирующихусловиях (7 М мочевина).
Б-E – Графики зависимости выхода транскрипта с промотора rrnB отконцентрации ДНК-матрицы (Б), MgCl2 (B), нуклеозидтрифосфатов (Г), гепарина (Д) иσA-фактора (Е). При варьировании концентрации NTP концентрация UTP была в 4 раза меньшеконцентраций каждого из остальных трех NTP. Максимальную эффективность транскрипции вкаждом эксперименте принимали за 100%.Для изучения влияния 6S-1 и 6S-2 РНК B.
subtilis на транскрипцию in vitro геновrrnB и veg РНК-полимеразу B. subtilis вначале инкубировали с эквимолярным количествомДНК-фрагмента (100 нМ) для образования «закрытого» комплекса на промоторе. Затем кпробам добавляли возрастающие количества 6S РНК (100-2000 нМ) и дополнительноинкубировали при 37°C для установления конкурентного равновесия между НКлигандами за связывание с активным центром РНКП.
Транскрипцию инициировалидобавлением смеси четырех NTP, содержащих [α-32Р]UTP, и снова выдерживали при 37°C.После денатурации РНКП (95°C, 5 мин) пробы анализировали в 5%-ном ПААГ,76содержащем 7 М мочевину. В условиях эксперимента добавление каждой из 6S РНКприводило к заметному уменьшению эффективности транскрипции с промоторов геновrrnB и veg (рис. II.10). Таким образом, обе 6S РНК B. subtilis способны специфическиингибировать транскрипцию in vitro.Рис.
II.10. Графики зависимости относительного выхода транскрипта с промоторов генаrrnB (А) и veg (Б) в зависимости от концентрации 6S-1 и 6S-2 РНК (100-2000 нМ). Ф. к.: 100 нМДНК, 100 нМ РНКП, 200 мкМ каждого из ATP, CTP, GTP, 50 мкМ UTP, 0,5 мкКи [α-32P]UTP.За 100% принимали уровень транскрипции в отсутствие 6S РНК.Аналогичные серии экспериментов были проведены при пониженной концентрациинуклеозидтрифосфатов – 50 мкМ каждого из ATP, CTP, GTP, 12,5 мкМ UTP (рис.
II.11).В этих условиях эффективность ингибирования транскрипции в присутствии таких жеизбытков 6S-1 и 6S-2 РНК существенно возросла (в среднем в 1,5-3 раза) и приблизилась к~ 100% при максимальной концентрации 6S РНК (дорожки 6 и 13 на рис. II.11А, Б).Такой эффект можно объяснить существованием равновесия между двумяконкурентными процессами, осуществляемыми РНК-полимеразой, – транскрипциеймРНК на ДНК-матрице и транскрипцией пРНК на матрице 6S РНК. СинтезированнаяпРНК остается связанной с 6S РНК и вызывает высвобождение РНКП из комплекса6S РНК:РНКП. При относительно низкой концентрации нуклеозидтрифосфатов (50 мкМ)этот процесс не столь значителен, тогда как её повышение до 200 мкМ вызывает заметноеснижение эффективности ингибирования транскрипции, поскольку синтез пРНК приводитк «инактивации» части молекул 6S РНК за счет комплексообразования с ними.
Подробнееэтот процесс описан в разделе II.5.Для подтверждения специфичности эффекта ингибирования транскрипции спомощью 6S-1 и 6S-2 РНК эксперименты также проводили в присутствии другой нкРНК РНК рибонуклеазы Р (РНКазы Р) B. subtilis (409 н.о.), которая не способнавзаимодействовать с РНКП [141]. Добавление РНК РНКазы Р лишь незначительноухудшает эффективность транскрипции (дорожки 16-20 на рис. II.11А, Б) по сравнению сингибирующим эффектом 6S-1 и 6S-2 РНК, главным образом при максимальной77концентрации.
Слабое негативное влияние на транскрипцию избытков неспецифическихРНК описано в литературе на примере 5S РНК и РНКП E. coli [32].Рис. II.11. Влияние 6S-1 РНК, 6S-2 РНК и РНК РНКазы Р* на транскрипцию с промоторовгенов rrnB (А) и veg (Б) в условиях пониженной концентрации нуклеозидтрифосфатов (50 мкМкаждого из ATP, CTP, GTP, 12,5 мкМ UTP). Радиоавтографы 5%-ных ПААГ после электрофорезав денатурирующих условиях (7 М мочевина) и соответствующие графики зависимости выходовтранскриптов от концентрации РНК. Дорожки 1, 8 и 15 – транскрипция в отсутствие нкРНК;дорожки 2-6, 9-13, 16-20 – транскрипция в присутствии возрастающей концентрации (1002000 нМ) 6S-1 РНК, 6S-2 РНК или РНК РНКазы Р, соответственно; дорожки 7 и 14 – маркердлины РНК (192 н.о., 5'-[32P]-меченная 6S-1 РНК).* Абсолютные значения интенсивностей радиоактивности продуктов транскрипции в присутствииРНК РНКазы Р иногда превышали интенсивности образца сравнения (т.е.
100%) из-за погрешностиэксперимента.В приведенных выше экспериментах эффективность ингибирования транскрипции спомощью 6S-1 и 6S-2 РНК была сравнительно одинакова для промотора гена veg, в товремя как транскрипция с промотора гена rrnB была немного менее «чувствительна» к786S-2 РНК.
Мы попытались более детально выяснить роль структуры ДНК-промотора вконкуренции с 6S-1 и 6S-2 РНК за связывание с РНКП. Из базы данных по регуляциитранскрипции B. subtilis DBTBS (Database of transcriptional regulation in Bacillus subtilis,http://dbtbs.hgc.jp/)были[142]выбранымодельныепромоторы,отличающихсянуклеотидными последовательностями -35 и -10 элементов и стартовой точкойтранскрипции. Основными критериями отбора являлись наличие экспериментальноопределенных TSS и промоторных элементов, а также отсутствие дополнительныхбелков-активаторов,необходимыхдлятранскрипциигена.Крометого,всеАрассматриваемые промоторы должны были быть σ -зависимыми.
В таблице II.1приведены основные сведения о 5 выбранных промоторах генов B. subtilis: rrnO-16S(далее rrnO), tuf, argC, appD, cspB, и об охарактеризованных ранее rrnB иveg (см. рис. II.8). Также в рассмотрение был взят промотор гена С2 фага φ29,инфицирующего B. subtilis. Отметим, что основное внимание было уделено именнонуклеотидным последовательностям выбранных промоторов, поэтому функции белков,которые кодируются данными генами, в настоящем исследовании не рассматриваются.Таблица II.1.
Характеристика промоторов генов B. subtilis, выбранных для изученияингибирующей функции 6S-1 и 6S-2 РНК.ГенБелокПромоторные элементы*-35-12/-10Стартовыйнуклеотид (+1)rrnBttgCAaTG_tataTtGvegБелок с неизвестными функциямиttgacataCaAtАrrnOttgacCTG_taCTatGtufФактор элонгации трансляции eFTuttgaTTtataaCGargCБелок, участвующий в биосинтезе ArgttgaATTG_tataatАappDБелок с неизвестными функциямиttgaTTtaATatАcspBБелок холодового шокаttgTTTTG_taGaGtАC2φ29Белок С2 бактериофага φ29ttgaAaTG_tataCtA+Т* Заглавными буквами выделены нуклеотиды, отличающиеся от консенсусных последовательностей-10 и -35 промоторных элементов B. subtilis.
Индекс d (дезокси) при написании последовательностей ДНКопущен.Все промоторы, кроме промотора гена cspB активны в экспоненциальной фазе ростаклетки. Выбор промоторов, активных в стационарной или других фазах роста (например,при споруляции или ответе на стрессовые условия) был затруднен, посколькутранскрипция генов с этих промоторов осуществляется, как правило, холоферментамиРНКП, содержащими альтернативные σ-факторы (в первую очередь σН) и/илирегулируется другими белками. На данный момент в литературе описано существованиеболее 17 различных σ-факторов РНКП, отвечающих за транскрипцию тех или иных79промоторов в клетке B. subtilis [143].
В итоге среди восьми используемых в исследованиипромоторов пять содержат расширенный -10 элемент. Стартовой точкой транскрипциидля четырех из восьми промоторов является остаток dA, и для трех – dG. Промотор генаС2 фага φ29 содержит две альтернативные стартовые точки транскрипции dA (+1) и dT(+2). Отметим, что в клетках B. subtilis 56% всех промоторов содержат остаток dA в +1положении, 38% - dG, 4,5% – dT и только 1,5% – dС [140].
Методом ПЦР былисинтезированыДНК-фрагментыдлиной220400н.п.(табл.II.2),содержащиесоответствующие промоторы генов. В качестве матрицы для ПЦР использовали геномнуюДНК B. subtilis 168. Праймеры для ПЦР подбирали таким образом, чтобы предполагаемаядлина продуктов транскрипции с полученных фрагментов ДНК варьировала в пределах ~100230 н.о.
для возможности проведения гель-электрофореза в одинаковых условиях.Таблица II.2. Значения длин ПЦР-фрагментов ДНК и предполагаемых РНК-транскриптовдля промоторов различных генов, используемых для изучения ингибирования транскрипции.ГенДлявсехДлинаДНК, н.п.РНК, н.о.argC234139appD310180cspB370232C2φ29268102/103tuf221120rrnO386132rrnB244131veg288148выбранныхпромоторовнаблюдалиэффективныйсинтезРНК-транскриптов в тестовых экспериментах (рис. II.12).Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
