Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Последующее повышение концентрации (NH4)2SO4 до65% (m/V) приводило к повторному осаждению РНКП, тогда как часть других белковоставалась в растворе. После растворения полученного осадка проводили вторую стадиюочистки препарата РНКП методом жидкостной хроматографии низкого давления наДЭАЭ-целлюлозе. Фракции, содержащие целевой белок, элюировали с колонкиступенчатым градиентом водного раствора KCl (300-350 мМ). На третьей стадииполученные белковые фракции очищали методом хроматографии на ДНК-целлюлозе.Варьирование концентрации KCl при элюции белка с колонки позволяет получать РНКПразличной степени чистоты (см.
главу «Экспериментальная часть»). В данной работе былииспользованы фракции, полученные при элюции белка 600-700 мМ раствором KCl. Послеобъединения целевых фракций, проведения диализа против буфера BIIG (см. главу«Экспериментальная часть») и концентрирования гомогенность полученного белка(РНКП-3) сравнили с препаратом РНКП, выделенным по Методике 2 (РНКП-2). Как видноиз рис. II.4, разработанный новый протокол выделения позволяет добиться существеннойстепени гомогенности препарата.
Однако транскрипционная активность РНКП-3 вэкспериментах по транскрипции in vitro (рис. II.5) была значительно ниже (~ 10 раз) посравнению с РНКП-2, возможно, из-за «потери» малых субъединиц в процессе очисткибелка.Таким образом, согласно Методике 3, был получен гомогенный препарат РНКП сконцентрацией 8 мг/мл (~ 2 мкМ). Из 1 л клеточной культуры, следуя данному протоколу,можно выделить ~ 2,2 мг белка.Рис.
II.5. Анализ активностивыделенных препаратов РНКП вреакции транскрипции in vitro вприсутствии четырех NTP (200 мкМкаждого) и 0,5 мкКи [α-32P]UTP.РНКП-2 – препарат РНКП B. subtilis,выделенный по Методике 2, РНКП-3 –выделенный по Методике 3.
Дорожки2-4 – транскрипция с промотора генаveg, дорожки 5-7 – транскрипция спромотора гена rrnB (см. раздел II.4).Дорожки 1 и 8 – маркер длины РНК(192 н.о., 5'-[32P]-меченная 6S-1 РНК).Радиоавтограф 5%-ного ПААГ послеэлектрофореза в денатурирующихусловиях (7 М мочевина).71II.3. Изучение комплексообразования 6S-1 и 6S-2 РНК с РНКПХарактерной чертой 6S РНК является её специфическое связывание с РНКП собразованием стабильного комплекса РНКП:6S РНК, аналогичного «открытому»комплексу фермента с промотором ДНК. Для проверки способности 6S-1 и 6S-2 РНКВ.
subtilis взаимодействовать с полимеразой, изучали комплексообразование полученныхТ7-транскрипцией5'-[32P]-меченных6SРНКихолоферментаРНКПВ. subtilisповышенной степени очистки (Методика 3 в главе «Экспериментальная часть»). Длявосстановления правильной вторичной структуры 6S-1 РНК и 6S-2 РНК непосредственноперед проведением комплексообразования проводили процедуру ренатурации (см. главу«Экспериментальная часть»).После совместной инкубации ренатурированных 6S РНК с РНКП в течение 30 минпри 37°С в буфере, содержащем различное количество гепарина (10-1000 нг/мкг) дляпредотвращения неспецифических взаимодействий, реакционные смеси анализировалиметодом «торможения в геле» в неденатурирующих условиях.
Поскольку молекулярнаямасса холофермента РНКП составляет ~ 400 кДа, электрофорез проводили в ПААГ низкойпроцентности (5%). Как в случае 6S-1 РНК, так и в случае 6S-2 РНК наблюдалиобразование единственного стабильного комплекса с РНКП, характеризующегося гораздоболее низкой подвижностью в геле по сравнению со свободными 6S РНК (рис. II.6).Рис. II.6.
Комплексообразование 5'-[32P]-меченных 6S-1 РНК и 6S-2 РНК (100 нМ) схолоферментом РНКП В. subtilis (500 нМ) в присутствии возрастающих количествгепарина (11000 нг/мкл соотвествует ~ 5мкМ5 мМ). Дорожки 2 и 11 комплексообразование6S-1 РНК и 6S-2 РНК с РНКП в отсутствие гепарина. Дорожки 1 и 10 исходные 6S-1 РНК и 6S-2РНК. Как 6S-1 РНК* и 6S-2 РНК* (выделены серым шрифтом) отмечены продукты неполнойренатурации РНК. Радиоавтограф 5%-ного ПААГ после электрофореза в неденатурирующихусловиях.72Увеличение концентрации неспецифического лиганда, конкурентно связывающегофермент, приводило лишь к незначительному уменьшению фракции комплексов6S-1 РНК:РНКП и 6S-2 РНК:РНКП.
Все последующие эксперименты проводили приконцентрации гепарина 100 нг/мкл (рис. II.6, дорожки 6 и 15). Отметим, что, несмотря намалое различие длин 6S-1 и 6S-2 РНК (192 н.о. и 204 н.о., соответственно), подвижностьдвухРНКвнеденатурирующемгелесущественноотличается.Этоможетсвидетельствовать о более компактной вторичной структуре 6S-1 РНК по сравнению с6S-2 РНК. Кроме того, 6S-2 РНК в неденатурирующих условиях, как правило, мигрирует вгеле в виде двух полос примерно одинаковой интенсивности, что говорит осуществовании в растворе равновесия между двумя или более конформациями молекулы.Для сравнения сродства 6S-1 и 6S-2 РНК к РНКП были проведены эксперименты попо анализу связывания фиксированного количества РНК (100 нМ) в присутсвиивозрастающих количеств фермента (50-3000 нМ) (рис. II.7А, Б).Рис.
II.7. Оценка сродства 6S-1 и 6S-2 РНК к РНКП В. subtilis. (А, Б) Комплексообразование6S-1 РНК и 6S-2 РНК (100 нМ) с холоферментом РНКП (50-3000 нМ) в присутствии 100 нг/мклгепарина (дорожки 2-14). Дорожки 1 исходные 6S-1 РНК или 6S-2 РНК. Радиоавтографы5%-ных ПААГ после электрофореза в неденатурирующих условиях. (В, Г) Графики зависимостистепени образования комплексов 6S-1 РНК:РНКП (B) и 6S-2 РНК:РНКП (Г) от концентрациихолофермента РНКП (50-3000 нМ).Интенсивности радиоактивных зон, соответствующих свободным 6S РНК и ихкомплексам с РНКП, обсчитывались, и на основании полученных результатов были73построены графики зависимости и определены равновесные константы диссоциации17 (Kd)образующихся комплексов 6S-1 РНК:РНКП и 6S-2 РНК:РНКП (рис.
II.7В, Г). Значение Kdдля комплексов 6S-1 РНК и 6S-2 РНК с РНКП имели сравнимые значения (460 ± 50 нМ и400 ± 60 нM, соответственно) в пределах погрешности эксперимента. Следовательно, обе6S РНК характеризуются близкой степенью сродства к ферменту.II. 4. Изучение конкуренции между 6S-1/6S-2 РНК и промоторами ДНК вусловиях транскрипции in vitroКак упоминалось ранее, основной функцией 6S РНК E. coli является ингибированиетранскрипции за счет конкуренции с промоторами ДНК за связывание с активнымцентром РНКП (раздел I.2.2.3 в главе «Обзор литературы»).
В данной работе прежде всегобыло необходимо выяснить, обладают ли 6S-1 и 6S-2 РНК В. subtilis этой способностью.В системе E. coli было обнаружено, что 6S РНК ингибирует транскрипцию генов впервую очередь с σ70-зависимых промоторов. В клетках В. subtilis гомологом σ70-фактораE.
coli является фактор σА, инициирующий транскрипцию более чем с 90% промоторовгенов «домашнего хозяйства», активных в экспоненциальной фазе роста клетки [139].Известно, что эффективность транскрипции определяется «силой» промотора, зависящейот его нуклеотидной последовательности, и природой стартового нуклеотида (TSS).σA-Зависимые консенсусные -10 и -35 промоторные элементы В.
subtilis не отличаются отE. coli и представляют собой гексануклеотиды 5'-d(TATAAT)-3' и 5'-d(TTGACA)-3',соответственно, расположенные в кодирующей цепи двутяжевой ДНК. Транскрипциягенов В. subtilis, активных в экспоненциальной фазе роста клетки, как правило,инициируется с dG в +1 позиции, тогда как для генов, активных в стационарной фазе,стартовой точкой транскрипции обычно является dA [140]. Поскольку профилиэкспрессии 6S-1 и 6S-2 РНК прямопротивоположны (максимум экспрессии 6S-1 РНКприходится на раннюю стационарную, а 6S-2 РНК – на экспоненциальную фазу ростаклетки [4]) было высказано предположение, что природа стартового нуклеотида такжеможет существенно влиять на наличие/отсутствие ингибирующего эффекта 6S РНК.Кроме того, в системе E.
coli было показано, что наиболее «чувствительными» кингибированию посредством 6S РНК являются гены с расширенной -10 промоторнойобластью, содержащей динуклеотид 5'-d(TG)-3' в -12 положении относительно TSS [34].Для исследования способности 6S-1 и 6S-2 РНК ингибировать транскрипцию намибыли17выбраныдваописанныхвлитературеσ A-зависимыхпромоторагеновKd, принималась равной концентрации фермента при 50%-ном связывании 6S РНК [138].74rrnB-16S (далее rrnB) и veg [140], кодирующих, соответственно, рибосомную РНК и белокс неизвестной функцией. Промотор гена rrnB содержал расширенную -10 промоторнуюобласть и dG в +1 позиции, тогда как транскрипция с промотора гена veg начиналась сdA (рис.
II.8).Рис. II.8. Организация промоторных областей генов rrnB и veg В. subtilis. Стрелкамиуказаны направления и стартовые точки транскрипции.Фрагменты ДНК (длиной 244 н.п. и 288 н.п.), содержащие соответствующиепромоторные элементы, получали с помощью ПЦР (см. главу «Экспериментальнаячасть»).
Транскрипцию in vitro проводили в присутствии [α-32P]UTP и холоферментаРНКП, выделенного согласно Методике 2 (см. главу «Экспериментальная часть»).Продуктыреакцииразделялив5%-номПААГвденатурирующихусловиях.Относительный выход РНК-транскрипта оценивали на основании обсчета интенсивностейсоответствующих радиоактивных зон, принимая максимальный результат за 100%. Напервом этапе в случае промотора гена rrnB были подобраны оптимальные условияреакции, обеспечивающие наиболее эффективный синтез РНК (рис. II.9). Как видно изрис.II.9А,активностьРНК-транскриптовменьшефермента192достаточнон.о.,чтовысока,соответствуетадлинадлине,полученныхпредсказаннойтеоретически (131 н.о.). Наибольшая эффективность транскрипции в присутствии 100 нМРНКП наблюдалась следующих условиях: 100 нМ ДНК-матрицы, 5 мМ MgCl2, 200 мкМкаждого из ATP, CTP, GTP, 50 мкМ UTP18 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
