Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Оба процесса существенно бы повлиялина набор продуктов транскрипции и их отличие от «стандартного» синтеза пРНК наматрице 6S РНК. Результаты экспериментов приведены на рис. II.27Б, В.На основании полученных данных можно сделать вывод, что взаимодействие20-звенной пРНК6S-2 с 6S-2 РНК исключает возможность синтеза пРНК de novo(рис. II.27Б, дорожка 5). Это еще раз доказывает стабильность комплекса 6S-2 РНК:р206S-2,а также невозможность его взаимодействия с РНКП.
В случае более коротких пРНК суменьшением ихдлины повышается вероятностьдиссоциациикомплекса 6S-2РНК:пРНК6S-2, высвобождения 6S-2 РНК и использование её РНК-полимеразой в качествематрицы для транскрипции пРНК de novo (рис. II.27Б, дорожки 6-10). Следуетподчеркнуть, что в этих случаях происходит транскрипция именно полноразмерныхпРНК,анеудлинениесинтетическихолигорибонуклеотидов,таккакприавторадиографии в дорожках 6-7 (рис. II.27Б) уже детектируются транскрипты длиной 1314 н.о. – более короткие, чем используемые синтетические пРНК (15-16 н.о.).Результаты аналогичных экспериментов с 6S-1 РНК приведены на рис. II.27В.Образование комплекса 14-звенной пРНК6S-1 с 6S-1 РНК исключает возможность синтезапРНК de novo (рис. II.27В, дорожка 4), тогда как в случае пРНК6S-1 длиной 13 и 12 н.о.транскрипциявозможна.Приавторадиографиивдорожках5-6(рис.II.27Б)детектируются только 14-звенные продукты транскрипции с матрицы 6S-1 РНК,поскольку их выход максимален.Исходя из полученных результатов, можно утверждать, что основные продуктытранскрипции in vitro с матрицы 6S-2 РНК (13-16 н.о.) являются нефункциональными, таккак при взаимодействии с 6S-2 РНК не могут предотвратить её связывание с РНКП.Однако, это возможно в случае синтеза 20-звенной пРНК6S-2, по своим свойстваманалогичной 14-звенной пРНК6S-1.
Следует ожидать, что более длинные вариантыпРНК6S-2 образуют еще более стабильные комплексы с 6S-2 и тоже препятствуютвзаимодействию молекулы с РНКП. Тем не менее, в условиях in vitro выход пРНК6S-299длиной больше 17 н.о. составляет меньше ~ 3% от общего количества пРНК6S-2 разнойдлины (см. рис. II.21). Низкая эффективность синтеза длинных пРНК6S-2 с точки зренияглобального механизма взаимодействия 6S-2 РНК с РНКП означает, что лишь малыйпроцентфермента,заблокированного«высвободиться» присинтезепРНК.вкомплексеТоестьсснятия6S-2РНК,эффектаимеетшансингибированиятранскрипции при синтезе пРНК6S-2 практически не происходит. Однако максимальныйуровень экспрессии 6S-2 РНК наблюдается в экспоненциальной фазе роста клеток(см.
раздел I.2.3.2 в главе «Обзор литературы»), то есть фазе активной транскрипциимножества генов «домашнего хозяйства». Возможно, снятие 6S-2 РНК-зависимогоингибирования транскрипции обусловлено специфическими механизмами, неизвестнымина настоящий момент и отличающимися от процессов, имеющих место в случае 6S-1 РНКB. subtilis и 6S РНК E. coli. Также не исключено, что тот малый процент функциональныхпРНК6S-2 длиной 20-24 н.о. in vivo является достаточным для поддержания необходимогобаланса между свободной РНКП и комплексом 6S-2 РНК:РНКП. Однако более вероятнымобъяснением является тот факт, что в определенных условиях (возможно, имеющих местоin vivo) транскрипция пРНК6S-2 может «сдвигаться» в сторону более длинныхтранскриптов.
В первую очередь это может происходить при изменении концентрациинуклеозидтрифосфатов, главным образом ATP и GTP. Известно, что изменение ихконцентраций при переходе клеток B. subtilis из экспоненциальной в стационарную фазуроста (понижение уровня GTP и возрастание ATP) вызывает существенные изменения втранскриптоме за счет активации транскрипции с альтернативных промоторов [140].К сожалению, на сегодняшний день не существует точных данных о физиологическихконцентрациях ATP и GTP в клетках B.
subtilis. В работе [149] концентрация ATP вэкспоненциальной фазе роста B. subtilis оценена как ~ 60 мкМ, тогда как внутриклеточныйуровень GTP по данным [150] достигает ~ 1-3 мМ. В более ранней работе уровень ATP вклеткеоцененкакв3-4разапревышающийконцентрацииостальныхтрехнуклеозидтрифосфатов [151].Для изучения зависимости выхода пРНК от концентрации ATP или GTPэксперименты по транскрипции in vitro с матрицы 6S-1 или 6S-2 РНК проводили,варьируя концентрацию этих нуклеозидтрифосфатов от 10 мкМ до 2 мМ в присутствиикаждого из остальных трех NTP в 200 мкМ концентрации (рис.
II.28 и II.29).Продемонстрировано, что синтез пРНК6S-1 малоэффективен в присутствии 10-20 мкМGTP, поскольку остаток G является первым нуклеотидом при транскрипции с матрицы6S-1 РНК, а дальнейшее повышение концентрации GTP от 50 мкМ до 2 мМ практическине влияет ни на эффективность, ни на соотношение длин продуктов транскрипции100(рис. II.28А). Изменение концентрации АTP не влияет на выход транскрипции in vitro,однако с увеличением количества ATP в реакционной смеси РНКП более эффективносинтезирует 15- и 16-звенные пРНК6S-1 (рис. II.28Б).Рис.
II.28. Влияние изменения концентрации GTP (А) и ATP (Б) на синтез пРНК на матрице6S-1 РНК. Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S-1 РНК; 100 нг/мкл гепарина; 200мкМ каждого из трехNTP, 0,5 мкКи [α-32P]UTP. (А) Дорожки 1 и 10 – маркеры длины РНК (М-13 и М-14),5'-[32P]-меченные олигорибонуклеотиды p136S-1 и р146S-1, соответственно. Дорожки 2-9 – синтезпРНК6S-1 в зависимости от концентрации GTP (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 и 2000 мкМ,соответственно). Дорожка 11 – реакционная смесь в отсутствие 6S-1 РНК (отрицательныйконтроль). (Б) Дорожка 1 – реакционная смесь в отсутствие 6S-1 РНК (отрицательный контроль).Дорожка 2 – маркер длины РНК (М-14), 5'-[32P]-меченный олигорибонуклеотид p146S-1. Дорожки3-10 – синтез пРНК6S-1 в зависимости от концентрации ATP (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 и2000 мкМ, соответственно).
Радиоавтографы 25%-ных ПААГ после электрофореза вденатурирующих условиях (7 М мочевина).Несмотря на то, что пРНК6S-2 содержит только два остатка G (в положениях 4 и 5),эффективность её синтеза меняется при изменении концентрации GTP (рис. II.29А) идостигает максимума при 500 мкМ, при этом соотношение длин продуктов реакции неизменяется.Наиболеезначимымрезультатомявляетсяобнаружениевысокойчувствительности эффективности синтеза пРНК6S-2 к концентрации ATP: при её низкихзначениях (10-20 мкМ) транскрипция с матрицы 6S-2 РНК невозможна и лишь вприсутствии 200-500 мкМ ATP выход транскрипции 13-16-звенных пРНК6S-2 становитсясравнимым с выходом пРНК6S-1 с матрицы 6S-1 РНК. Более того, дальнейшее увеличениеконцентрации ATP (1-2 мМ) приводит к заметному увеличению эффективности синтезапротяженныхтранскриптовдлиной23-26н.о.(рис.
II.29Б).Приэтомдлинапреобладающих продуктов транскрипции «смещается» в сторону 15-18 н.о. (по сравнениюс 13-16 н.о. при 200 мкМ ATP). Напомним, что транскрипция с матрицы 6S-2 РНК101начинается с трех подряд остатков А, а полноразмерные пРНК6S-2 (13-26 н.о.) содержат всреднем 55% остатков А от общего числа нуклеотидов.Рис. II.29.
Влияние изменения концентрации GTP (А) и ATP (Б) на синтез пРНК на матрице6S-2 РНК. Ф. к.: 1 мкМ РНКП; 1 мкМ 6S-2 РНК; 100 нг/мкл гепарина; 200мкМ каждого из трехNTP, 0,5 мкКи [α-32P]АTP (при варьировании концентрации GТР) или [α-32P]UTP (приварьировании концентрации АТР). (А) Дорожки 1 и 10 – маркеры длины РНК (М-15 и М-12),5'-[32P]-меченные олигорибонуклеотиды p156S-2 и p126S-2. Дорожки 2-9 – синтез пРНК6S-2 взависимости от концентрации GTP (10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 и 2000 мкМ, соответственно).(Б) Дорожка 1 – реакционная смесь в отсутствие 6S-2 РНК (отрицательный контроль).Дорожки 2 и 11 – маркеры длины РНК (М-15 и М-12), 5'-[32P]-меченные олигорибонуклеотидыp156S-2 и p126S-2. Дорожки 3-10 – синтез пРНК6S-2 в зависимости от концентрации ATP (10, 20, 50,100, 200, 500, 1000 и 2000 мкМ, соответственно).
Радиоавтографы 25%-ных ПААГ послеэлектрофореза в денатурирующих условиях (7 М мочевина).Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что транскрипция пРНК сматрицы 6S-1 РНК может осуществляться в широком диапазоне концентраций GTP и ATPс высокой эффективностью. Эффективный синтез пРНК с матрицы 6S-2 РНК возможентолько в присутствии сравнительного большего количества ATP (0,22 мМ).
Более того,образование длинных пРНК6S-2, формирующих стабильный комплекс с 6S-2 РНК и темсамым инициирующих высвобождение РНКП из её комплекса с 6S-2 РНК действительнопроисходит при высокой концентрации ATP ( > 1 мМ). Однако вопрос, какие условияin vivoсоответствуютнеобходимомудлясинтезафункциональныхпРНК6S-2внутриклеточному уровню ATP, остается открытым.Еще одним возможным фактором, сдвигающим синтез пРНК в сторону болеедлинныхиликороткихтранскриптов,можетявлятьсятемпература,посколькустабильность дуплексов 6S РНК:пРНК должна прямо пропорционально зависеть оттемпературных условий, в которых находится клетка. Результаты транскрипции с102матрицы 6S-1 или 6S-2 РНК при различных температурах в диапазоне 4-50°С приведенына рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
