Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Напомним,что синтез пРНК в стационарной фазе (точки dg) ещё не означает снятие эффектаингибирования РНКП (см. раздел II.5). Согласно данным секвенирования (см. выше), вэтой фазе происходит транскрипция, главным образом, олигорибонуклеотидов длиной8-12 н.о. [152], которые неспособны оставаться прочно связанными с 6S-1 РНК и неприводят к диссоциации комплекса 6S-1 РНК:РНКП.
Таким свойством обладают только14-звенные пРНК-транскрипты, синтез которых аккумулируется на стадии выхода из110стационарной фазы.В случае 6S-2 РНК детектировать статистически значимые сигналы,соотвествующие пРНК6S-2 не удалось. Мы предположили, что более эффективный синтезпРНК6S-2 может происходить в мутантных клеточных линиях ΔbsrA и ΔbsrAB+B,поскольку в отсутствие 6S-1 РНК концентрация 6S-2 РНК оставалась высокой напротяжении всего времени культивирования клеток (рис.II.36А, Б).
Вероятно, встационарной фазе 6S-1 РНК должна ингибировать помимо транскрипции различныхгенов и транскрипцию 6S-2 РНК, а в её отсутствие (в нокаутных клетках ΔbsrA иΔbsrAB+B) этого не происходит.Результаты блот-гибридизации общей РНК, выделенных из клеточных линий ΔbsrA,ΔbsrAB+B и ΔbsrB (отрицательный контроль), с зондом к пРНК6S-2 приведены на рис.II.36В. Для повышения чувствительности детекции гибридизацию проводили притемпературе 25°С, что, однако, снижает специфичность детекции.Рис. II.36. Анализ профилей экспрессии 6S-2 РНК в клетках ΔbsrA и ΔbsrAB+B (А, Б) ипРНК6S-2 в клетках ΔbsrA, ΔbsrB и ΔbsrAB+B (В).
(А) Результаты блот-гибридизации общейРНК (3 мкг), выделенной на различных стадиях роста клеток ΔbsrA и ΔbsrAB+B, с зондами к 6S-2и 5S РНК. (Б) Диаграммы уровней экспрессии 6S-2 РНК в клетках ΔbsrA и ΔbsrAB+B(нормированных по концентрации 5S РНК) в промежутки времени, соответствующие точкамотбора клеточной культуры. За единицу принимали минимальную концентрацию 6S-2 РНК (вточке g).
(В) Результаты блот-гибридизации общей РНК (10 мкг), выделенной на различныхстадиях роста клеток ΔbsrA, ΔbsrAB+B и ΔbsrB с зондом к пРНК6S-2. Буквами (a-g) отмечено времяотбора аликвот клеточной культуры для выделения общей РНК: 3, 4,5, 6, 10, 24, 36 и 48 ч,соответственно, буквой z в круге отмечена аликвота клеточной культуры, использовавшаяся длямоделирования стадии выхода из стационарной фазы роста клеток (см.
рис. II.34).111Максимальная интенсивность сигналов, вероятно, соответствующих пРНК6S-2,наблюдалась для клеточной линии ΔbsrAB+B с комплементом гена bsrB, однако длинадетектируемых РНК была несколько больше ожидаемой. Аналогичные сигналы в общейРНК, выделенной из клеток ΔbsrB, отсутствовали, хотя в дорожках f и z детектировалисьсигналы, расположенные немного выше предполагаемых сигналов пРНК6S-2.
Именно вэтих образцах (f и z), как правило, наблюдается максимальный синтез пРНК6S-1 (рис.II.35Б), которая может неспецифически гибридизоваться с зондом к пРНК6S-2, хотявероятность такого процесса крайне низка (см. рис. II.33). В клетках ΔbsrA и ΔbsrAB+Bнеспецифическая гибридизация с пРНК6S-1 исключена в связи с отсутствием 6S-1 РНК.Зонд к пРНК6S-2 также может гибридизоваться с продуктами деградации 6S-2 РНК, однакони в одном из проанализированных образцов общей РНК не наблюдался заметный распад6S-2 РНК.Сигналы пРНК6S-2, детектируемые в клеточной линии ΔbsrAB+B, достаточноинтенсивны,имогутрассматриватьсякакэкспериментальноесвидетельствотранскрипции пРНК с матрицы 6S-2 РНК in vivo. Можно предположить, что онисоответствуют протяженным пРНК6S-2 длиной 23-26 н.о., синтез которых in vitro былописан в разделе II.5. Однако в клетках дикого типа аналогичные сигналы не былиобнаружены, поэтому вопрос об условиях, в которых синтез пРНК6S-2 происходит in vivoостается открытым.II.
6. 3. Влияние делеций генов bsrA и bsrB на экспрессию белков B. subtilisЯвляясь глобальным ингибитором транскрипции, 6S РНК существенно влияет наэкспрессиюбольшогочислабелков.КакбылоописановразделеI.2.2.1,транскрипционная активность более чем 500 генов E. coli изменяется (увеличивается илиуменьшается) в отсутствие 6S РНК [35]. Однако данных о влиянии 6S-1 и 6S-2 РНК наэкспрессию генов B.
subtilis до настоящей работы в литературе представлено не было.Поскольку максимальная концентрация 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis в клеткенаблюдается в различных фазах клеточного роста (см. рис. II.34B), можно предположить,что эти нкРНК ингибируют транскрипцию с промоторов, активных в той или иной фазе.Соответственно, состав клеточных белков в присутствии и в отсутствие 6S-1 и/или6S-2 РНК B. subtilis должен отличаться.Чтобы проверить эту гипотезу, был проведен сравнительный анализ полныхпротеомов нокаутных клеточных линий B. subtilis и клеток дикого типа.
Для этого всеклеточные культуры выращивали в отсутствие антибиотиков для исключения ихвозможного влияния на экспрессию клеточных белков и корректного сравнения с112клетками «дикого» типа (не имеющими резистентности к антибиотикам). Отбор аликвотдля выделения общего белка проводили после достижения значений оптическойплотности А600 ~ 1 О.Е. (после ~ 3 ч от начала культивирования, средняяэкспоненциальная фаза роста) и А600 ~ 4 О.Е. (после ~ 8 ч от начала культивирования,ранняя стационарная фаза роста).
Выбор времени отбора проб был продиктованхарактером изменения концентраций 6S-1 и 6S-2 РНК: при значении оптическойплотности клеточной культуры А600 ~ 1 О.Е. 6S-2 РНК должна количественно преобладатьнад 6S-1 РНК, а в точке, соответствующей А600 ~ 4 О.Е., концентрация полноразмерной6S-1 РНК уже достигает практически максимального значения, при этом деградациямолекулы проявляется еще не столь значительно.В белки из сравниваемых клеточных линий вводили разные лизин-специфичныефлуоресцентные красители – гидроксисукцинимидные эфиры Су3 и Су5.
Каждый изфлуоресцентных красителей характеризуется собственными длинами волн поглощения ииспускания (Cy3: λпогл = 550 нм, λисп = 570 нм (зеленый); Cy5: λпогл = 649 нм,λисп = 670 нм (красный)). Окрашенные образцы белков смешивали в эквимолярномсоотношениииполученнуюсмесьанализировалиметодомдвумерногогель-электрофореза (см. главу «Экспериментальная часть») (Схема II.1).
В первом направлениибелки разделяли по разнице их электрических зарядов методом изоэлектрическогофокусирования(ИЭФ).Вовторомнаправлениипроводилиэлектрофорезвденатурирующих условиях (ДСН-ПААГ), разделяя белки по молекулярным массам. Такойподход позволяет достичь высокой степени разрешения белков.Схема II.1.113Дифференциальное мечение белковых фракций из двух клеточных линийфлуоресцентными красителями Су3 и Су5 позволяет довольно точно детектироватьизмененияконцентрацииконкретныхбелков.Наизображениигелябелкам,содержащимся в сравниваемых образцах в равных количествах, соответствуют зоныжелтого цвета за счет наложения флуоресценции Cy3 (зеленый цвет) и Cy5 (красныйцвет). Соответственно, белки, преобладающие в одном из образцов, визуализируются ввиде зон красного или зеленого цвета (Схема II.1).На рис.
II.37 приведены изображения гелей после двумерного электрофореза вслучае, когда общую белковую фракцию из клеток «дикого» типа, выделенную вэкспоненциальной фазе роста, метили красителем Cy3 (зеленая флуоресценция), а изклеток штамма ΔbsrА или ΔbsrВ – красителем Cy5 (красная флуоресценция).Рис. II.37. Сравнительный протеомный анализ белковых фракций, выделенных изклеточных линий B. subtilis дикого типа (PY79) и мутантных штаммов ΔbsrA (А) и ΔbsrB (Б) вэкспоненциальной фазе роста (А600 ~ 1 О.Е.). Зоны красного и зеленого цвета на двумерном гелесоответствуют белкам, уровень экспрессии которых, соответственно, увеличивается илиуменьшается, при делеции гена bsrA или bsrB. Идентифицированные с помощью массспектрометрии MALDI-TOF белки подписаны. Красным шрифтом выделены названия белков,экспрессия которых ингибируется обеими 6S РНК, белым – только 6S-2 РНК.Экспрессия большинства детектируемых белков несущественно изменяется вотсутствие 6S-1 РНК (рис.
II.37А, желтые зоны), поскольку концентрация этой нкРНК вэкспоненциальной фазе роста клеток низка. Тем не менее, выявлено как минимум трибелка, эффективность синтеза которых увеличивалась в клетках ΔbsrА (рис. II.37А,красные зоны). После окрашивания геля раствором солей серебра, соответствующие этимбелкам зоны вырезали из геля и подвергали трипсинолизу с последующим анализомполученных пептидов методом масс-спектрометрии MALDI-TOF.
В результате были114идентифицированы белки AhpC, RplJ и KatA (табл. II.3). Уровень их экспрессииповышался и в отсутствие 6S-2 РНК (рис. II.37Б). Однако, при делеции гена bsrB былизаметны гораздо более существенные изменения в клеточном протеоме по сравнению склетками дикого типа – резко возрастало количество зон красного цвета, относящихся кбелкам, более эффективно экспрессирующимся в нокаутной клеточной линии brsB.Методом масс-спектрометрии MALDI-TOF помимо белков AhpC, RplJ и KatA былоидентифицировано ещё 8 характерных белков: AcoB, , Mdh, MntA, PyrG, SufC, TpiA иYvyD (рис. II.37Б, табл. II.3 и II.4)Отметим, что в ходе экспериментов не было зафиксировано белков, полностьюотсутствующих в одной из клеточных линий, например, не экспрессирующихся вприсутствии 6S РНК, что свидетельствует о невозможности 100%-ного ингибированияэкспрессии того или иного белка с помощью 6S-1 или 6S-2 РНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
