Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 26

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 26)

Клеточные линии E. coli и B. subtilis, использованные в работе.Клеточная линияГенотипrE. coli DH5αF–80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) recA1 gyrA endA1relA1supE44 hsdR17B. subtilis MH5636trpC2 pheA1 10×His-rpoCB. subtilis NA110trpC2 spo0A3 suB. subtilis 168trpC2B. subtilis PY79Trp+, SPβ (прототроф)B. subtilis MWbsrAPY79 bsrA::spc(Spr)B. subtilis MWbsrBPY79 bsrB::kan(Kmr)B. subtilis MWbsrABPY79 bsrA::spc(Spr)bsrB::kan(Kmr)B. subtilis MWbsrAB+AMWbsrAB pDG364bsrA(Cmr)B. subtilis MWbsrAB+BMWbsrAB pDG364bsrB(Cmr)r-устойчивость к антибиотикам: спектиномицину (Spr, 100 мкг/мл), канамицину (Kmr, 10 мкг/мл) илихлорамфениколу (Cmr, 5 мкг/мл) соответственно.Олигодезоксирибонуклеотиды.

В качестве праймеров для ПЦР в работе былииспользованы коммерческие олигодезоксирибонуклеотиды (Integrated DNA Technologies,США и Noxxon, Германия). Часть праймеров была синтезирована стандартнымамидофосфитным методом на автоматическом ДНК-синтезаторе ASM-800 (БИОССЕТ,Россия) с.н.с., к.х.н. Романовой Е.А. (НИИ ФХБ МГУ имени М.В. Ломоносова). Очисткупраймеров проводили методом гель-фильтрации на колонках IllustraTM NAP-5 (GEHealthcare, США) и с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (7 Ммочевина).Плазмиды pNG132, pNG219, pNG540, pNG545 и pNG567 для выделения корфермента РНКП и σA-субъединицы B.

subtilis любезно предоставлены проф. Р. Льюисом(Ньюкаслскийуниверситет,г.Каллахен,Австралия).ПлазмидаpUC18любезнопредоставлена проф. Р. Хартманном (Марбургский университет имени Филиппса,120Германия). Плазмиды pBB_T7_bsrA и pBB_T7_bsrB сконструированы в данной работе наоснове вектора pUC18 (табл. III.2).Таблица III.2. Плазмиды, использованные в работе.ПлазмидаpUC18ГенотипrpMB1(Apr)pBB_T7_bsrA10 bsrA (Apr)pBB_T7_bsrB10 bsrB (Apr)pNG132bla Pφ10-6×His-sigA-Tφ (Apr)pNG219bla P φ10-rpoA-rpoB-rpoC-9×His-Tφ (Apr)pNG540bla Pφ10-yloH-rpoC-9×His-Tφ (Apr)pNG545cat lacI Pφ10lac-rpoA-rpoB-Tφ (Cmr)pNG567bla Pφ10-ykzG-rpoC-9×His-Tφ (Apr)r-устойчивость к антибиотикам: ампициллину (Apr, 100 мкг/мл) или хлорамфениколу (Cmr,30 мкг/мл), Pφ10  T7-фаговый промотор, Tφ  терминатор T7-транскрипцииБуферные растворы:BI: 50 мM Трис–HCl (pH 8,4), 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 7 мM 2-меркаптоэтанолBII: 25 мM Трис–HCl (pH 8,4), 1 мМ ЭДТА, 7 мM 2-меркаптоэтанол, 15 % (V/V)глицеринаBIIG: 25 мM Трис–HCl (pH 8,4), 1 мМ ЭДТА, 7 мM 2-меркаптоэтанол, 50 % (V/V)глицеринаLAP: 50 мМ Трис-HCl (pH 6,8), 2,5% (m/V) ДСН, 10% (V/V) глицерина, 0,5% (V/V)β-меркаптоэтанола, 0,01% (m/V) БФСTE: 10 мМ Трис (рН 8,0), 1 мМ ЭДТАTBE: 50 мМ Трис-H3BO3 (pH 8,3), 1 мM ЭДТАTBS: 50 мM Трис-HCl (pH 7,6), 150 мM NaClTG: 25 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 250 мМ глицин, 0,1% (m/V) ДСНLM: 0,2 M Трис–HCl (pH 8,0), 25 мM MgCl2, 0,8 M KCl, 5 мM ДТТSD: 50 мМ NaH2PO4 (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 20% (V/V) глицеринаSE: 50 мМ NaH2PO4 (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазолSL: 50 мМ NaH2PO4 (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,5 мг/мл лизоцимаSW: 50 мМ NaH2PO4 (pH 8,0), 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазолR: 20 мМ KH2PO4 (pH 8,0), 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазолRD: 20 мM Трис-HCl (pH 7,8), 150 мM NaCl, 1 мM ЭДТАRS: 20 мM Трис-HCl (pH 7,8), 150 мM NaCl, 10 мМ MgCl2, 30% (V/V) глицеринаSW1: 300 М NaCl, 30 мМ цитрат натрия, 0,1% ДСН, рН 7,0SW2: 15 мМ NaCl, 1,5 мМ цитрат натрия, 0,1% ДСН, рН 7,0121Буфер А: 125 мM Трис-HCl (pH 6,8), 6 M мочевина, 30% (V/V) глицерина,2% (m/V) ДСНБуфер Б: 50 мМ NH4HCO3 (pH 7,8), 40% (V/V) ацетонитрилаБуфер В: 100 мМ NH4HCO3 (рН 7,8)Буфер Г: 50 мM Na2HPO3 (pH 7,1), 300 мM NaCl, 3 мM 2-меркаптоэтанол,5% (V/V) глицеринаБуфер Д: 50 мM Трис–HCl (pH 8,0), 3 мM 2-меркаптоэтанол, 50% (V/V) глицеринаБуфер Е: 80 мМ HEPES (pH 8,0), 15 мМ ДТТ, 33 мМ MgCl2, 1 мМ спермидинаБуфер Ж: 30 мМ Трис-HCl (pH 8,5), 7 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% (V/V)CHAPS/ Nonidet P-40Водные растворы:Р1: 80% (V/V) формамида, 0,025% (m/V) БФС, 0,025% (m/V) КЦР2: 10% (V/V) уксусной кислоты, 20% (V/V) этилового спиртаР3: 0,1% (m/V) AgNO3, 3,7% (m/V) формальдегидаР4: 4% (m/V) Na2CO3, 6×(10-4)% (m/V) Na2S2O3×5H2O, 3,7% (m/V) формальдегидаР5: 0,2 М Na2S2O3, 30 мМ K4[Fe(CN)6]P6: 0,130 мМ N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодимид гидрохлорида (EDC),0,160 мМ 1-метилимидазола, рН 8,0Р7: 30% (m/V) CHAPS, 10% (m/V) Nonidet P-40Питательные клеточные среды, на 1 л воды:LB: 5 г NaCl, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта (pH 7,5)LBD: 5 г NaCl, 5 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 10 г декстрозы (pH 7,5)LB-агар: 5 г NaCl, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г агара (pH 7,5)Вода различной степени очистки:ddH2O – бидистиллированная вода (дистиллят).

Использовалась для приготовлениябуферов для электрофореза и питательных сред.Milli-Q H2O – вода, очищенная с помощью прибора для фильтрации (EMD Millipore,США). Использовалась для приготовления всех растворов для реакционных смесей сучастием РНК и ДНК.CHROMASOLVH2O(Sigma-Aldrich,США)–водадляхроматографии.Использовалась для приготовления всех растворов для проведения 2D-электрофорезабелков (если не указано иное) и их последующего выделения для идентификации.122III. 2. Приборы и методыМикрообъемы растворов дозировали автоматическими дозаторами Pipetman (Gilson,Франция) с точностью 5%. Центрифугирование образцов в пробирках объемом 0,5 мл и1,5 мл проводили на микроцентрифугах Costar (США) и Eppendorf (Германия).

Клеточныекультуры центрифугировали в пробирках объемом 50 мл или стаканах Клеточныекультуры центрифугировали в пробирках объемом 50 мл или стаканах объемом 250 мл внастольной центрифуге Eppendorf (Германия). Измерение рН растворов проводили налабораторном рН-метре модели PB-11 (Sartorius, Германия) с точностью до 0,01 единицырН. Термостатирование проб проводили в термостатах Термит (ДНК-технология, Россия)и Thermocycler T1 (Biometra, Германия). Питательные среды, растворы для выделениябелков и лабораторный пластик для работы с РНК автоклавировали в автоклаве модели2540 МК (Tuttnauer, Израиль-США).Выращивание клеточных культур B.

subtilis и E. coli. Клетки из глицериновыхстоков (-80°С) инокулировали на чашках Петри с питательной средой LB-агар,содержащей необходимое количество соответствующего антибиотика. После 12-18часовой инкубации при 37°С чашки герметично закрывали и помещали на 4°С.

Дляинокуляции ночных культур (5 мл, LB), содержащих необходимое количествосоответствующего антибиотика, отбирали единичные колонии с чашек Петри.Спектры поглощения клеточных культур в УФ-области записывали наспектрофотометре CARY 50 Bio UV-Visible (Varian, США) длине волны 595 нм водноразовых полистироловых кюветах (Sarstedt, Германия).Спектры поглощения водных растворов фрагментов ДНК и РНК в УФ-областизаписывали на спектрофотометре CARY 50 Bio UV-Visible (Varian, США) при длиневолны 260 нм. Использовали кювету TrayCell (Hellma Analytic, США). Объем пробсоставлял5 мкл.Концентрациюнуклеотидногоматериалаопределялиспектрофотометрически по формуле Бугера-Ламберта-Бера: C = A260/(260×l), где С –концентрация нуклеотидного материала, М; A260 – оптическая плотность раствора при260 нм; 260 – молярный коэффициент экстинкции при 260 нм, М-1см-1; l – длинаоптического пути, 0,1 см.

Молярные коэффициенты экстинкции олигонуклеотидов ифрагментов РНК рассчитывали с помощью программы OligoAnalyzer 3.1 (SciTools,Молярныеwww.idtdna.com).рассчитывалиспомощьюкоэффициентыэкстинкциисоответствующего(260)приложенияПЦР-фрагментовнасервереhttp://biophysics.idtdna.com/.123Электрофорез ПЦР-фрагментов и плазмидных ДНК в неденатурирующихусловиях проводили в плоском 12,5×8,5×0,4 см агарозном геле, содержащем 1% агарозы вTBE-буфере с бромидом этидия (0,5 мкг/мл) при напряженности поля 5 В/см. Переднанесением в гель пробы (5-10 мкл) смешивали с 1-2 мкл 6-кратного раствора OrangeDNA Loading Dye (Thermo Ficher Scientific, США).

После электрофореза гелифотографировали под УФ-светом (λ=365 нм).Электрофорезденатурирующихолигодезоксирибонуклеотидовусловияхпроводилив25%-номи(дляРНК-фрагментовпРНК),20%-номв(дляолигодезоксирибонуклеотидов), 8%-ном (для 6S РНК) или 5%-ном (для продуктовтранскрипции) ПААГ (20×20×0,1 см), содержащем 19% (m/V) акриламида, 1% (m/V) N,N’метиленбисакриламида и 7 М мочевину, в TBE-буфере при напряженности поля 50 В/см.Префорез проводили в течение 30 мин, электрофорез – в течение 1-8 ч. Пробы наносилина гель в 20-30 мкл раствора Р1 в случае олигодезоксирибонуклеотидов или в 20 мклбуфера для нанесения в гель RNA Loading Dye (Thermo Fisher Scientific, США) вслучае РНК.Элюция олигодезоксирибонуклеотидов из геля.

К фрагментам геля, содержащимолигодезоксирибонуклеотиды добавляли 200 мкл 2 М LiClO4 и инкубировали 16-18 ч прикомнатной температуре. Затем отбирали раствор, промывали гель 100 мкл 2 М LiClO 4,объединяли с первой фракцией и добавляли ацетон до объёма 1,5 мл. Полученный растворцентрифугировали 2 мин при 14500 об./мин, жидкость над осадком отбирали. К осадкудобавляли 50 мкл 2 М LiClO4 и 500 мкл ацетона, центрифугировали 2 мин при 14500об./мин, отбиралижидкость, добавляли косадку 500 мклацетона исновацентрифугировали. Промывку ацетоном повторяли.

После высушивания на воздухеосадокрастворялив Milli-QH2Oиопределяликонцентрациюолигодезоксирибонуклеотидов спектрофотометрически.Экстракция ДНК и РНК из водных растворов. К раствору ДНК или РНКдобавляли эквивалентный объем фенола, насыщенного TE-буфером (pH 8,0) или 300 мМрастворомAcONa(рН4,9)соответственно.Смесьэнергичновстряхивалиицентрифугировали 5 мин на скорости 13500 об./мин при комнатной температуре, затемводную фазу отбирали в новую пробирку и добавляли эквивалентный объем хлороформаи повторяли процедуру.

Целевые ДНК и РНК из полученной водной фазы осаждали 2,5объемами предварительно охлажденного (-20°С) абс. EtOH в присутствии 0,3 M AcONa,инкубировали при -20°С не менее 2 ч, центрифугировали (5 мин, 13500 об./мин, 4°С) ипосле высушивания на воздухе (~ 5 мин) растворяли в Milli-Q H2O.124Выделение общей РНК из различных клеточных линий B. subtilis («горячийфенольный» метод). Для выделения больших количеств общей клеточной РНКиспользовали «горячий фенольный» метод, описанный в работе [155]. Клеточный осадок(из 25-100 мл клеточной культуры) энергично ресуспендировали в 12 мл охлажденного(4°C) буфера для экстракции (10 мМ NaOAc, pH 4,8, 150 мМ сахарозы) на «вортексе».Затем к клеточной суспензии добавляли 400 мкл раствора лизоцима (20 мг/мл) в TEбуфере и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин.

Характеристики

Список файлов диссертации