Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 28
Текст из файла (страница 28)
Отобранные клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 4000об./мин, 4°C), жидкость над осадком удаляли. Осадок клеточной биомассы замораживалив жидком азоте и хранили при -80°C.Выращивание клеточных линий B. subtilis PY79, dbsrA, dbsrB, dbsrAB, dbsrAB+Aи dbsrAB+B для выделения общего белка. Ночные культуры клеток, выращенные всреде LB с добавлением соответствующего антибиотика (см. табл.
1), разбавляли 100 млсвежей питательной среды LB до А600 ~ 0,05 О.Е. и выращивали при 37°C иперемешивании 250 об./мин. При достижении оптической плотности А 600 ~ 1,0 О.Е.половину клеточной культуры (50 мл) отбирали, а оставшиеся 50 мл продолжаликультивировать до достижении оптической плотности А600 ~ 4,0 О.Е. Отобранные клетки128осаждали центрифугированием (15 мин, 4000 об./мин, 4°C), жидкость над осадкомудаляли. Осадок замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C.Выделение σA-субъединицы РНКП B. subtilis. Выделение σA-субъединицы РНКПB.
subtilis проводили согласно протоколу, описанному в работе [131]. Клетки E. coli DH5α,трансформированные плазмидой pNG132, культивировали в среде LB в присутствииампициллина (100 мкг/мл) при 37°С и 220 об./мин до достижения значения оптическойплотности А600 ~ 0,4 О.Е. Затем индуцировали экспрессию белка добавлением 0,5 мМИПТГ, и культивировали клетки еще 5 ч при 20ºС и 160 об./мин. Клетки осаждалицентрифугированием в течение 5 мин при 4°C со скоростью 4000 об./мин (Eppendorf5810R, США). Осадок ресуспендировали в буфере для лизиса SL в расчете 5 мл буфера на1 г клеточной биомассы.
Клеточную суспензию обрабатывали ультразвуком надезинтеграторе Branson-250 (Branson Ultrasonics Corporation, США) в течение 10 мин(облучение импульсами длительностью 15 с, интервал – 15 с, 4°C) и центрифугировали 45мин при 4°C со скоростью 8000 об./мин. Жидкость над осадком смешивали всоотношении 1:10 (V/V) с суспензией Ni2+-NTA-агарозы (предварительно уравновешеннойбуфером для лизиса SL) и инкубировали при медленном перемешивании 30 мин при 8°C.Далее аликвоты суспензии последовательно переносили на колонку Micro Bio-SpinTMChromatographyColumn(Bio-Rad,США)иотделялиNi2+-NTA-агарозуцентрифугированием 30 с при скорости 2400 об./мин.
Затем колонку промывали 10-тьюобъемами буфера SW и элюировали белок аликвотами буфера SE объемом 0,5 мл. Составэлюированных фракций анализировали методом гель-электрофореза по Лэммли.Содержащие целевой белок фракции объединяли и проводили диализ при 4°C противбуфера SD. Полученный белковый препарат хранили при -70°C .ВыделениеРНКПB. subtilis.Выделениекор-ферментаРНКПB. subtilis(Методика 1) проводили согласно протоколу, описанному в работе [131]. Препаратхолофермента σA-РНКП для его последующего использования в экспериментах потранскрипции in vitro выделяли по упрощенной методике (Методика 2) на основепротокола, описанного в работе [132].
Для остальных экспериментов использовалитщательно очищенную σA-РНКП, выделенную по оригинальной методике (Методика 3),разработанной в сотрудничестве с проф. М. Салас и сотр. (Центр молекулярной биологииимени С. Очоа, Автономный Университет Мадрида, Испания).Методика 1. Клетки E.
coli DH5α, трансформированные плазмидой pNG219 (длявыделения не содержащего ω-субъединицу кор-фермента РНКП) культивировали в средеLB в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) при 37°С и 220 об./мин до достижения129значения оптической плотности А600 ~ 0,5 О.Е. Затем индуцировали экспрессию белкадобавлением 0,05 мМ ИПТГ, и культивировали клетки еще 5 ч при 20ºС и 160 об./мин.Клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 4°C со скоростью4000 об./мин (Eppendorf 5810R, США). Клетки E. coli DH5α, трансформированныеодновременно двумя плазмидами: pNG545/540 (для выделения кор-ω1-РНКП) илиpNG545/567 (для выделения кор-ω2-РНКП), культивировали в среде LB, содержащей0,1% (m/V) глюкозы в ампициллина и хлорамфеникола (50 мкг/мл и 30 мкг/мкл,соответственно) при 37°С и 220 об./мин до достижения значения оптической плотностиА600 ~ 0,50,7 О.Е.
Затем индуцировали экспрессию белка добавлением 0,5 мМ ИПТГ, икультивироваликлеткиеще5чпри20ºСи160 об./мин. Клеткиосаждалицентрифугированием в течение 5 мин при 4°C со скоростью 4000 об./мин (Eppendorf5810R, США). Дальнейшее выделение и очистку различных вариантов кор-РНКПпроводили в одинаковых условиях.Клеточную биомассу ресуспендировали в буфере R (в расчете 5 мл буфера на 1 гклеточной биомассы), содержащем 0, 05% (m/V) Triton X-100, 0,5 мг/мл лизоцима и1 мМ PMSF.
Клеточную суспензию обрабатывали ультразвуком на дезинтегратореBranson-250 (Branson Ultrasonics Corporation, США) в течение 10 мин (облучениеимпульсами длительностью 15 с, интервал – 15 с, 4°C) и центрифугировали 45 мин при4°C со скоростью 8000 об./мин. Жидкость над осадком фильтровали с помощьюмембранного фильтра из ацетата целлюлозы (диаметр пор 0,45 мкм) и наносили наколонку His-Trap (GE Healthcare, США) объемом 1 мл, предварительно уравновешеннуюбуфером R. Затем колонку промывали 10-тью мл буфера R, содержащего 45 мМимидазол, и элюировали аликвотами по 0,5 мл буфера R, содержащего 200 мМ имидазол.Состав элюированных фракций анализировали методом гель-электрофореза по Лэммли.Содержащие целевой белок фракции объединяли и проводили диализ при 4°C противбуфера RD.
Диализат наносили на колонку MonoQ (GE Healthcare, США) объемом 1 мл,предварительно уравновешенную буфером RD. Хроматографию проводили 10-тьюобъемами буфера RD в линейном градиенте NaCl oт 150 мМ до 1 М при скорости 1мл/мин. Фракции, содержащие целевой белок (~ 400500 мМ NaCl) объединяли ипроводил диализ при 4°C против буфера RS. Полученный белковый препарат хранилипри -70°C .Методика 2. Ночные культуры B.
subtilis MH5636 (А600 ~ 5-6 О.Е.) разбавляли свежейпитательной средой LBD (1:1000) и выращивали при 37°C в условиях интенсивнойаэрации (300 об./мин) до А600 ~ 1,2 О.Е. Осажденные центрифугированием клетки (15 мин,4000 об./мин, 4°C) ресуспендировали в буфере Г (в расчете 3 мл буфера на 1 г клеток),130содержащем 1 таблетку предварительно растворенного ингибитора протеаз ProteaseInhibitor Cocktail (Roche, США), и лизировали ультразвуком (20 циклов: облучениеимпульсами длительностью 15 с, интервал – 15 с) в бане со льдом.
Клеточную биомассуосаждали центрифугированием (15 мин, 13500 об./мин, 4°C). К отобранной жидкости надосадком добавлялисуспензиюNi2+-NTA-агарозы в соотношении 1:10(V/V) иинкубировали при медленном перемешивании 30 мин при 8°C. Далее аликвоты суспензии(0,6-0,8 мл) последовательно переносили на колонку Micro Bio-SpinTM ChromatographyColumn (Bio-Rad, США) и отделяли Ni2+-NTA-агарозу центрифугированием 30 с прискорости 2400 об./мин. После этого сорбент промывали 20-тью объемами буфера Г(рис. III.1, дорожка 2) и 20-тью объемами буфера Г, содержащим 60 мМ имидазол (рис.III.1, дорожки 3-4).
РНКП элюировали аликвотами по 0,5 мл буфера Г, содержащим 400мМ имидазол (рис. III.1, дорожки 6-8). Состав собранных фракций анализировали спомощью гель-электрофореза по Лэммли (рис. III.1). Фракции, содержащие РНКП,подвергали диализу в течение 12 ч в буфере Д при 4°C и хранили при -20°C.Рис. III.1. Электрофоретический анализ (15%-ный ДСН-ПААГ) состава фракций в процессевыделения РНКП B. subtilis методом хроматографии на Ni2+-NTA-агарозе . Дорожка 1 – фракция,не сорбируемая на Ni2+-NTA-агарозе; дорожка 2 – фракция, полученная после промывки сорбентабуфером Г; дорожки 3 и 4 – первая и вторая половина фракции, полученной после промывкисорбента буфером Г, содержащим 60 мМ имидазол; дорожки 6-8 – фракции, полученные в ходеэлюции белка буфером Г, содержащим 400 мМ имидазол.
Дорожка 5 - набор белков-маркеровмолекулярной массы, кДа (указаны слева). Фотография после окрашивания раствором кумассиG-250.Методика 3. Клетки B. subtilis NA110 культивировали в питательной среде LB,дополнительно содержащей 5 мМ MgSO4, при 37°C в условиях интенсивной аэрации (300об./мин),додостиженияоптическойплотностиА420~1,52О.Е.Послецентрифугирования в течение 30 мин при скорости 4000 об./мин (4°C) осажденные клетки(~ 4 г/л клеточной культуры) ресуспендировали в буфере для лизиса BI (в расчете 2 мл131буфера на 1 г клеточной биомассы), содержащем 0,5 мг/мл лизоцима и 2 мМфенилметилсульфонилфторид (PMSF), и инкубировали при слабом перемешивании 18 чпри 4°C. Затем проводили первую стадию очистки фермента (Схема III.1, серым цветомвыделены фракции, не содержащие целевой белок).Схема III.1.К 100 мл клеточной суспензии прибавляли 3,1 мл 30%-ного (m/V) раствораПЭГ-6000 (Sigma, США) и 0,9 мл 20%-ного (m/V) раствора декстрана-500 в 0,1 M HEPES(pH 7,0) и инкубировали при слабом перемешивании 20 мин при 4°C.
Послецентрифугирования (30 мин, 12000 об./мин, 4°C) осажденную биомассу (Осадок-1 наСхеме III.1) ресуспендировали в 2,4-кратном объеме буфера BI, добавляли раствор ПЭГ6000 до концентрации 9% (m/V) и кристаллический NaCl (Ф. к. 1,5 М) и инкубировали 25мин при 4°C при медленном помешивании. После центрифугирования (30 мин, 12000об./мин, 4°C) и отделения осадка (Осадок-2 на Схеме III.1) процедуру повторяли,добавляя кристаллический NaCl до концентрации 4 М. После центрифугированияотбирали жидкость над осадком (Раствор-3 на Схеме III.1) и проводили диализ противбуфера BI в течение 4 ч при 4°C (после 2 ч производили замену буфера).
КонцентрациюNaCl в растворе после диализа проверяли методом кондуктометрии. Если концентрацияNaCl превышала 0,5 М, раствор разбавляли до нужного объема буфером BI. На каждойстадии очистки отбирали аликвоты для анализа белкового состава с помощью гельэлектрофореза по Лэммли (рис. III.2).132Рис. III.2. Анализ фракций в процессе выделения и очистки холофермента РНКП B.subtilisсогласно Методике 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
