Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 31
Текст из файла (страница 31)
subtilis проводили с помощьюнерадиоактивной блот-гибридизации с использованием дигоксигенин-(DIG)-меченныхРНК-зондов, полученных T7-транскрипцией в присутствии DIG-11-UTP (схема III.2) спомощью коммерческого набора Northern Starter Kit (Roche Diagnostics, Швейцария). Вкачестве матриц для транскрипции использовали ПЦР-фрагменты ДНК, содержащиенуклеотидные последовательности которых комплементарны 6S-1, 6S-2 или 5S РНКB. subtilis (антисмысловые). Согласно коммерческому протоколу (Roche Diagnostics,Швейцария) 1 мкг ПЦР-фрагмента смешивали в объеме 20 мкл с 2 мкл 10-кратногораствора для введения остатка DIG в РНК (10 мМ ATP, CTP, GTP (каждого), 6,5 мМ UTP,3,5 мМ DIG-11-UTP), 2 мкл 5-картного буфера для транскрипции (0,4 М Трис-HCl, рН 8,0,60 мМ MgCl2, 100 мM ДТТ, 20 мМ спермидина) и 2 мкл РНК-полимеразыТ7 (20 ед.
акт./мкл). После инкубации в течение 2 ч при 37°C в реакционную смесь141добавляли вторую аликвоту РНК-полимеразы Т7 (2 мкл) и дополнительно инкубировали1 ч при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 200 мМ ЭДТА (рН 8,0),разделяли на две части (~ 10 мкл) и замораживали при -20°C. Полученный раствор РНКзонда (10 мкл) размораживали непосредственно перед использованием.Схема III.2.Детекцию пРНК проводили с помощью комплементарных пРНК6S-1 или пРНК6S-2DIG-меченных олигодезоксинуклеотидов, содержащих остатки ковалентно замкнутыхнуклеозидов (LNA). В контрольном эксперименте также использовали 15-звенный 5'-[32Р]меченный зонд к пРНК6S-2 (табл. III.9). Все LNA-содержащие олигонуклеотиды былисинтезированы компанией Exiqon (Дания).Таблица III.9. Олигорибонуклеотиды – зонды к пРНК, использованные в работе.НазваниеНуклеотидная последовательность*L146S-15'-DIG–d(AGTTTTGACCGAAC)-3'L126S-25'-DIG–d(GTTTTAACCTTT)-3'L156S-25'-d(TAAGTTTTAACCTTT)-3'* N- остаток LNAПодготовка мембран с фрагментами РНК к гибридизации.
Реакционные смесиобъемом 10 мкл полученные после транскрипции in vitro с матрицы 6S-1 и 6S-2 РНК иливодные растворы (10 мкл) общей РНК, выделенной из клеток B. subtilis (3 мкг длядетекции 5S и 6S РНК, 10 мкг для детекции пРНК) смешивали с 2 мкл 6-кратного буферадля нанесения в гель DNA Loading Dye (Thermo Fisher Sceintific, США), инкубировали втечении 5 мин при 95°C с последующим охлаждением во льду и проводили последующееразделение методом электрофореза в 10%-ном ПААГ в неденатурирующих условиях (длядетекции пРНК) или в 7%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (7 М мочевина, длядетекции 6S РНК). Иммобилизацию фрагментов РНК на положительно заряженнуюнейлоновую мембрану (Roche Diagnostics, Швейцария) проводили, используя прибор дляполусухого переноса (C.B.S. Scientific Company, США) в 0 ,5-кратном буфере TBE принапряженности поля 3.75 мА/см2 в течении 18 ч при комнатной температуре.142Для фиксации длинных фрагментов РНК (для детекции 5S и 6S РНК) мембранупомещали на чистое стекло и инкубировали в течение 1 ч при 80°C.Для фиксации коротких фрагментов РНК (для детекции пРНК) мембранупереносили на целлюлозную подложку, пропитанную водным раствором P6 (в расчете~ 24 мл раствора на мембрану размером 5×10 см), помещали в герметичную емкость иинкубировали в течение 2 ч при 60°C.
В результате фрагменты РНК взаимодействовали саминогруппами на поверхности мембраны.Иммуноферментный анализ (блот-гибридизация) фрагментов РНК. Послеиммобилизации фрагментов РНК на мембране её дважды промывали ddH2O, помещали впластиковый флакон с завинчивающейся крышкой, добавляли 10 мл раствора длягибридизации, приготовленного из гранул DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics, Швейцария) ипреинкубировали в течение 2 ч при 68°C в гибридизационной печи при постоянномперемешивании. Затем раствор для гибридизации декантировали, и к мембране добавлялисвежий подогретый до 68°C гибридизационный раствор, содержащий 30 мкМ DIGмеченного олигорибонуклеотида-зонда к пРНК6S-1 или пРНК6S-2 или 10 мкл раствора DIGмеченных зондов к 6S-1, 6S-2 и 5S РНК B.
subtilis. Перед добавлением к раствору длягибридизации аликвоты водных растворов РНК-зондов инкубировали в течение 5 мин при95°C с последующим охлаждением в бане со льдом для денатурации. Гибридизациюпроводили в течение 18 ч при 68°C, после чего мембрану сначала промывали буферомSW1 (2 раза по 5 мин, 37°C), а затем буфером SW2 (2 раза по 15 мин, 68°C).Иммунодетекцию проводили, используя коммерческие поликлональные антитела кдигоксигенину Anti-DIG-AP (Roche Diagnostics, Швейцария) согласно инструкциям,указанным в коммерческом протоколе. Выделенные из клеток овцы Fab-фрагменты (DIGантитела) ковалентно связаны со щелочной фосфатазой.
В процессе детекции онидефосфорилируют коммерческий реагент CDP-star (Roche Diagnostics, Швейцария). Врезультатепроисходитразгораниелюминесценции(λ = 465нм).Сигналыхемилюминисценции детектировали с помощью рентгеновской фотопленки KodakBioMax Light (Sigma Aldrich, США), которую затем сканировали на приборе GS-800(BioRad, США). Время экспозиции фотопленки на мембране варьировали от 15 с до 2 ч взависимости от интенсивности сигнала.Введениефлуоресцентнойметки(Cy3,Cy5)вбелки.Осажденнуюизамороженную биомассу клеток дважды промывали 10-20 мл буфера TBS иресуспендировали в водном растворе Р7.
Клетки разрушали последовательнымзамораживанием в жидком азоте/размораживанием в водяной бане (37оC) в течение 5143циклов. Затем добавляли 10 мкл смеси РНКазы А и ДНКазы I (10 ед. акт. каждой, ThermoFicher Scientific, США), растворенных в 10 мкл буфера для ДНКазы I (10 мМ Трис-HCl(pH 7,5), 10 мМ CaCl2, 10 мМ MgCl2, 50% (V/V) глицерина) и инкубировали в бане сольдом 30 мин. В клеточную суспензию добавляли буфер Ж до объема 100 мкл,инкубировали в бане со льдом 15 мин и центрифугировали 5 мин со скоростью 13500об./мин.
Жидкость над осадком переносили в новые пробирки. Суммарную концентрациюбелков в полученных образцах оценивали по методу Бредфорд. Для введенияфлуоресцентных меток использовали гидроксисукцинимидные эфиры красителей Cy3 илиCy5, реагирующие с остатками Lys белков. Реакционная смесь содержала 400 пмольреагента в расчете на 50-100 мкг суммарного белка. Смесь инкубировали 30 мин в бане сольдом в темноте. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 10 мМ водного растворализина.
Эффективность введения флуоресцентных меток контролировали при помощиразделения окрашенных образцов белков (~ 2 мкг) в одномерном ДСН-ПААГ, поочереднодетектируя флуоресценцию Cy3 и Cy5 с помощью сканера флуоресценции Typhoon FLA9500 Biomolecular Imager. Для исключения возможности различного влияния Cy3 и Cy5 наподвижность одного и того же белка проводили контрольный эксперимент (рис.
III.4).Рис. III.4. Двумерный электрофорез белковых фракций, выделенных из клеток B. subtilisдикого типа (PY79) в экспоненциальной (А) и стационарной фазах роста (Б). Контрольныйэксперимент: эквимолярные количества одного белкового образца метили Cy5 или Cy3 исмешивали.Эквимолярные количества белковой фракции, выделенной из клеток дикого типа,метили Cy3 или Cy5, смешивали и проводили двумерный гель-электрофорез. В этомслучае не было замечено появления зон красного или зеленого цвета, которые могли бысвидетельствовать об измененной подвижности белка с одним флуоресцентнымкрасителем по сравнению с этим же белком, меченным другим флуорофором (рис. III.4).144ВЫВОДЫ1.Впервые продемонстрирована способность 6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis ингибироватьin vitro транскрипцию с модельных промоторов генов rrnB, rrnO, veg, tuf, argC, appDи cspB B.
subtilis и С2 фага φ29. Установлено, что обе 6S РНК проявляют сравнимуюэффективность ингибирования транскрипции вне зависимости от нуклеотидныхпоследовательностей промоторных элементов выбранных генов и природыстартового нуклеотида.2.Разработана методика выделения холофермента РНК-полимеразы B. subtilis (РНКП),показано его специфическое взаимодействие как с 6S-1, так и с 6S-2 РНК B. subtilis.Константы диссоциации комплексов 6S-1 РНК:РНКП и 6S-2 РНК:РНКП имеютсопоставимые значения.3.Впервые продемонстрирован in vitro синтез коротких фрагментов РНК (пРНК) на6S-1 и 6S-2 РНК B. subtilis в качестве матриц для транскрипции и определены ихнуклеотидные последовательности.
Длина преобладающих пРНК-транскриптовсоставляет 14 н.о. для пРНК6S-1 и 13-16 н.о. для пРНК6S-2. В случае 6S-2 РНКвозможен синтез длинных транскриптов до 26 н.о., эффективность которого прямопропорциональна концентрации аденозинтрифосфата.4.Установлено, что и пРНК6S-1, и пРНК6S-2 формируют РНК-РНК дуплексы с 6S-1 и6S-2 РНК, соответственно.
Показано, что 14-звенная пРНК6S-1 образует стабильныйкомплекс с 6S-1 РНК и блокирует доступ к ней РНК-полимеразы. В случае 6S-2 РНКсравнимая стабильность комплекса с пРНК6S-2 наблюдается только для 20-звенныхтранскриптов.5.Впервые показано, что делеции генов bsrA и bsrB, кодирующих 6S-1 и 6S-2 РНК,влияют на экспрессию белков в клетках B. subtilis.
Установлено, что ингибированиеэкспрессии белков AhpC, KatA, Mdh, MntA, RplJ, SufC, TpiA и YvyD может бытьвызвано влиянием как 6S-1, так и 6S-2 РНК. Снижение уровня экспрессии белковAcoB, GapA и PyrG связано с присутствием в клетке 6S-2 РНК. Всеидентифицированные белки участвуют в процессах метаболизма, в частности вусловиях окислительного стресса, аминокислотного голодания и холодового шока.145СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.Wassarman K.M., Storz G. 6S RNA regulates E.
coli RNA polymerase activity. // Cell.2000. V. 101. P. 613-623.2.Barrandon C., Spiluttini B., Bensaude O. Non-coding RNAs regulating the transcriptionalmachinery. // Biol. Cell. 2008. V. 100. P. 83-95.3.Wassarman K.M., Saecker R.M.
Synthesis-mediated release of a small RNA inhibitor ofRNA polymerase. // Science. 2006. V. 314. P. 1601-1603.4.Barrick J.E., Sudarsan N., Weinberg Z., Ruzzo W.L., Breaker R.R. 6S RNA is awidespread regulator of eubacterial RNA polymerase that resembles an open promoter. //RNA. 2005. V. 11. P. 774-784.5.Kobayashi K., Ehrlich S.D., Albertini A., Amati G., Andersen K.K., Arnaud M., Asai K.,Ashikaga S., Aymerich S., Bessieres P., et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
