Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 29
Текст из файла (страница 29)
(А) Первая стадия выделения фермента (см. Схему III.1). Дорожка 1 –исходный клеточный лизат, дорожка 2 – растворенный осадок-1 (после осаждения ПЭГ идекстраном), дорожка 3 – раствор-1 (после осаждения ПЭГ и декстраном), дорожка 4 – раствор-2,дорожка 5 – раствор-3, дорожка 7 – водная фаза-4 (33% (m/V) (NH4)2SO4), дорожка 8 – раствор-5(65% (m/V) (NH4)2SO4). (Б) Вторая стадия выделения РНКП – хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе.Дорожка 1 – белковая фракция до нанесения на колонку, дорожка 2 – белковая фракция, несорбируемая на ДЭАЭ-целлюлозе, дорожки 3-9 – фракции, полученные после промывки сорбентааликвотами буфера BII с возрастающей концентрацией KCl (175–350 мМ). (В) Третья стадиявыделения РНКП – хроматография на ДНК-целлюлозе. Дорожка 1 – белковая фракция донанесения на колонку, дорожка 2 – белковая фракция, не сорбируемая на ДНК-целлюлозе,дорожки 3-9 – фракции, полученные после промывки сорбента аликвотами буфера BII свозрастающей концентрацией KCl (150–700 мМ).На следующей стадии в раствор после диализа добавляли кристаллический(NH4)2SO4 до достижения концентрации 33% (m/V) и после инкубации в бане со льдом втечение 20 мин центрифугировали (20 мин, 12000 об./мин, 4°C) до расслоения воднойфазы и ПЭГ.
К отобранной фазе (Водная фаза-4 на Схеме III.1) добавляликристаллический (NH4)2SO4 до достижения концентрации 65% (m/V) и повторялипроцедуру. После центрифугирования (20 мин, 12000 об./мин, 4°C) выпавший осадок(Осадок-5 на Схеме III.1) растворяли в буфере BII и наносили на предварительноуравновешенную буфером BII колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (Sigma, США) в течении 12 ч133при 4°C (в расчете 10 мл объема колонки на 10 г исходной клеточной биомассы).
Белокэлюировали буфером BII со ступенчатым градиентом концентрации KCl (175350 мМ).Фракции, содержащие целевой белок (300-350 мМ KCl, рис. III.2Б), объединяли,разбавляли буфером BII до концентрации KCl 125 мМ и наносили на колонку с ДНКцеллюлозой (Sigma, США), предварительно уравновешенную буфером BII, содержащим125 мМ KCl. Элюцию проводили буфером BII со ступенчатым градиентом концентрацииKCl (125700 мМ).
Фракции, содержащие целевой белок (600700 мМ KCl, рис. III.2В),объединяли и проводили диализ против буфера BIIG с последующим концентрированиемпрепаратаРНКПвцентрифужныхконцентраторахAmiconUltra-230000NMWL (Millipore, США).Конструкция плазмидных ДНК, содержащих гены bsrA и bsrB. Фрагменты ДНК,содержащие нуклеотидные последовательности генов bsrA и bsrB были полученыметодом ПЦР с использованием праймеров, содержащих участки узнавания эндонуклеазрестрикции EcoRI (5'-d(G↓AATTC)-3' / 3'-CTTAA↑G-5') и HindIII (5'-d(A↓AGCTT)-3' /3'-d(TTCGA↑A)-5'), а также последовательность T7-промотора (табл.
III.3).Таблица III.3. Праймеры для ПЦР фрагментов ДНК, содержащих последовательности геновbsrA и bsrB.Название*Праймеры*(олигодезоксирибонуклеотиды)bsrA_F5'-CAGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAGTCCTGATGTGTTAGTTGTACACCTAG-3'bsrA_R5'-CAGAAGCTTAAAGTCCCAATAGTGCCGTTG-3'bsrB_F5'-CAGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGAAGCTACTTTGTGCGTATTGTTAATTAAG-3'brsB_R5'-CAGAAGCTTATTTCCGAAAAGGAAATGGCTTTC-3'* F – «прямой» праймер (от англ.
«forward»), R – «обратный» праймер (от англ. «reverse»). Индексd(дезокси) при написании последовательностей ДНК опущен.** Участки узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII подчеркнуты, последовательностьТ7-промотора выделена жирным курсивом.В качестве матрицы для синтеза фрагментов ДНК, использовали геномную ДНКB. subtilis 168. ПЦР проводили по стандартному протоколу (95°С 60 c, 54°С – 60 с, 72°С– 40 с, цикл повторяли 25 раз). После очистки продуктов реакции полученные ДНКподвергали ферментативному гидролизу: ~ 5 мкг фрагмента ДНК смешивали в 50 мклбуфера для гидролиза (10 мМ Трис-HCl, pH 8,5, 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl,0,1 мг/мл БСА) с 2 мкл (10 е.а./мкл) каждой из эндонуклеаз рестрикции EcoRI и HindIII(Thermo Fisher Scientific, США) и инкубировали в течение 2 ч при 37°С.
Аналогичнуюреакцию проводили для линеаризации вектора pUC18 (см. табл. III.2). Степень гидролизаДНК в обоих случаях оценивали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле споследующим прокрашиванием раствором бромида этидия. После выделения и очистки с134помощью коммерческого набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Нидерланды)целевых ДНК с «липкими концами» проводили их лигирование: 200 нг линеаризованноговектора pUC18 смешивали с 200 нг фрагмента ДНК (содержащего гены bsrA или bsrB) в20 мкл буфера для Т4 ДНК-лигазы (40 мМ Трис-HCl, pH 7,8, 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ,0,5 мМ АТР) с 2 мкл (5 е.а./мкл) Т4 ДНК-лигазы (Thermo Fisher Scientific, США) иинкубировали в течение 18 ч при 4°С.
Продукты лигирования трансформировали вкомпетентные клетки E. coli штамма DH5α.Выделение плазмидных ДНК pBB_T7_bsrA и pBB_T7_bsrB для Т7-транскрипции6S-1 и 6S-2 РНК проводили с помощью коммерческого набора NucleoBond PC(«Macherey-Nagel», Германия). Ночные культуры соответствующих клеточных линийвыращивали в 3 мл питательной среды LB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина при37ºС в течение 16-18 ч при 220 об./мин, а затем переносили в 500 мл свежей среды LB(содержащей 100 мкг/мл ампициллина) и выращивали при 37ºС, 220 об./мин до A600 ~ 3-4О.Е. Клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 4000 об./мин, 4ºС).
Далее проводиливыделение плазмид на колонке NucleoBond AX 2000 (Mega) согласно коммерческомупротоколу. На последней стадии выделения ДНК осаждали изопропанолом при комнатнойтемпературе, центрифугировали (13500 об./мин в течение 30 мин при 4°C), аккуратносливали жидкость, осадок высушивали 1-2 мин на воздухе. Выделенную ДНК немедленнорастворяли в 200-300 мкл ddH2O и измеряли оптическую плотность раствора.Концентрацию ДНК определяли из допущения, что А260 = 1 о.е./мл пропорционально 50мкг/мл плазмидной ДНК.
Далее плазмидную ДНК переводили в линейную форму спомощью эндонуклеазы рестрикции Fast Digest HindIII (Thermo Ficher Scientific, США).Гидролиз проводили в течение 2 ч при 37°C в буфере Fast Digest Green Buffer (ThermoFicher Scientific, США). Объем реакционной смеси составлял 200-500 мкл. Длярасщепления 1 мкг ДНК использовали 1 ед. акт. фермента. Продукты реакциианализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Гидролизованную ДНКвыделяли из смеси фенол-хлороформной экстракцией с последующим осаждением ДНКиз полученной водной фазы 2,5 объемами абс.
EtOH в присутствии 0,083 М AcONa.Ферментативный синтез и выделение 6S-1 и 6S-2 РНК. 6S-1 РНК (192 н.о.) и6S-2 РНК (204 н.о.) B. subtilis получали с помощью Т7-транскрипции. Реакционная смесь(общий объем 0,5 мл) содержала буфер Е, 15 мМ каждого NTP, 40 мкг линеаризованнойплазмидной ДНК и 1 ед. акт./мл пирофосфатазы. Реакционную смесь инкубировали 5 минпри 37°C и добавляли 150 мкл 30 мМ раствора гуанозина в ТЕ-буфере, предварительнонагретого до 75°C (Ф.
к. 9 мМ). Это позволяло получить транскрипты с 5'-ОН концевой135группой для последующего введения32Р-метки. Реакцию инициировали добавлением10 мкл Т7 РНКП (~ 40 ед. акт./мкл) и инкубировали 2 ч при 37°C. Затем добавляли вторуюаликвоту Т7 РНКП (10 мкл) и реакционную смесь инкубировали еще 2 ч при 37°C.Выделение целевых РНК проводили в 8%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину, споследующейвизуализациейподУФ-светом.Квырезаннымфрагментамгеля,содержащим 6S РНК, добавляли 1 М AcONa и инкубировали при 4-8ºС в течение 14-18 ч.Затем раствор переносили в чистую пробирку, добавляли 2,5-кратный объем абс. EtOH,инкубировали при -20ºС 2 ч и центрифугировали 30 мин при 4ºС со скоростью13500 об./мин Жидкость над осадком декантировал, осадок высушивали 5-10 мин навоздухе.
Осажденную РНК растворяли в Milli-Q H2O и определяли концентрациюраствора спектофотометрически.РНК РНКазы Р B.subtilis длиной 409 н.о. (также полученная с помощью Т7транскрипции) любезно предоставлена проф. Р. Хартманном (Марбургский университетимени Филиппса, Германия).Выделение геномной ДНК B. subtilis. 3 мл ночной культуры клеток B. subtilis 168 всреде LB центрифугировали 10 мин при 7000 об./мин для осаждения клеток.Образовавшийся осадок после двухкратного промывания TE-буфером ресуспендировалив 300 мкл TE-буфера, добавляли 30 мкл раствора лизоцима (20 мг/мл в ТЕ-буфере) иинкубировали при 37ºС в течение 10 мин. Затем добавляли 100 мкл 10%-ного ДСН, 100мкл 5 М NaClO4, 500 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1, V/V) и в течение30 с энергично встряхивали пробирку. Затем центрифугировали в течение 5 мин при13000 об./мин, удаляли верхнюю фазу и добавляли 800 мкл охлажденного EtOH (-20°С).Образовавшийся осадок ДНК переносили в новую пробирку, промывали 200 мкл 70%ного EtOH, центрифугировали 5 мин при 13000 об./мин, отбирали жидкую фазу ивысушивали ДНК не более 1-2 мин на воздухе с последующим растворением в Milli-QH2O.Синтез фрагментов ДНК, содержащих промоторные области генов B.
subtilis,методом полимеразной цепной реакции. В качестве матрицы для синтеза фрагментовДНК, содержащих следующие промоторы B. subtilis: rrnB, rrnO, veg, tuf, argC, appD, cspB,использовали геномную ДНК B. subtilis 168. Для синтеза фрагмента ДНК, содержащегопромотор гена C2 фага φ29 использовали фаговую ДНК, любезно предоставленную проф.М. Салас (Центр молекулярной биологии имени С. Очоа, Автономный УниверситетМадрида, Испания). Реакцию проводили в 50 мкл Taq-буфера (75 мМ Трис-HCl, рН 8,8,13620 мМ (NH4)2SO4, 0,01% (V/V) Tween-20) в присутствии 2,5 мМ MgCl2, 0,25 мМ смесичетырех dNTP, 50 мкМ каждого из праймеров (табл. III.4), 1 ед.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
