Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 27
Текст из файла (страница 27)
После добавления1,3 мкл 10%-ного раствора ДСН и 3 мл подогретого до 65°C фенола (насыщенного 10 мМNaOAc, pH 4,8) смесь энергично перемешивали с последующей инкубацией при 65°C (5мин), и при 4°C (5 мин, в бане со льдом), а затем центрифугировали (20 мин, 12000об./мин, 4°C). Верхнюю водную фазу отбирали в чистую пробирку и проводилифенол/хлороформную экстракцию с последующем осаждением РНК этанолом. ОсадоквыделеннойобщейРНКрастворялив20-100мклddH2O,определялиспектрофотометрически концентрации растворов РНК, замораживали их в жидком азоте ихранили при -80°C.Определение концентрации белков в препаратах методом Брэдфорд проводилипо стандартной методике в двух различных вариантах. В обоих случаях вначале строиликалибровочную прямую величин поглощения растворов БСА заданных концентраций.В первом варианте к 800 мкл водного раствора БСА заданной концентрации (1-8 мкг/мл)или водного раствора РНКП B.
subtilis добавляли 200 мкл реагента Protein Assay DyeReagent Concentrate («Bio-Rad», США), перемешивали и через ~ 5 мин записывали спектрпоглощения раствора на спектрофотометре CARY 50 Bio UV-Visible при длине волны595 нм. Во втором случае 5 мкл водного раствора БСА заданной концентрации(100-1500 мкг/мл) или 5 мкл водного раствора препарата белка для последующего2D-гель-электрофореза смешивали с 250 мкл реагента Coomassie (Bradford) Protein AssayReagent («Thermo Ficher Scientific», США) в плоскодонном 96-луночном планшете и через5 мин записывали спектр поглощения раствора на иммуноферментном планшетноманализаторе StatFax 2100 («Awareness Technology», США) при длине волны 595 нм.Электрофорез белков и клеточных лизатов (гель-электрофорез по Лэммли)проводили в ПААГ (10×10×0,1 см), содержащем 0,1% (m/V) ДСН, в буфере TG принапряженности поля 20 В/см. Разделяющий гель (15%): 15% (m/V) акриламида,0,52% (m/V) N,N′-метиленбисакриламида, 0,1% (m/V) ДСН, 375 мМ Трис-НСl (рН 8,8).Концентрирующийгель(4%):3,66%(m/V)акриламида,0,13%(m/V)N,N′-метиленбисакриламида, 0,1% (m/V) ДСН, 125 мМ Трис-НСl (рН 6,8).
Пробынаносили на гель в 20 мкл буфера LAP после предварительного прогрева в течение 3–5125мин при 95ºС. Для визуализации результатов электрофореза использовали окрашиваниебелков по коммерческому протоколу раствором PageBlue™ на основе кумассибриллиантового синего G-250 (Thermo Fisher Scientific, США).Двумерный белковый гель-электрофорез. Равные (по суммарной величинефлуоресценции) количества сравниваемых образцов белков смешивали (~ 30-40 мкл) идобавляли 0,8 мкл 50%-ного водного раствора ДТТ (финальная конфентрация (Ф.
к.) 1%(m/V)) и 0,8 мкл раствора амфолинов 3-10 (Ф. к. 1% (V/V), BioRad, США). ИЭФ проводилив камере для электрофореза Protean II xi 2-D Cell (BioRad, США) с использованиемстеклянных капилляров длиной 180 мм, заполненных 4%-ным ПААГ (8 М мочевина, 5%(m/V)амфолинов3–10,2,4%(m/V)каждогоизнеионныхдетергентовCHAPS/Nonidet P-40). Для ИЭФ использовали следующую программу: линейныйградиент напряжения от 200 до 600 В – 6 ч, затем 700 В – 10 ч и 900 В – 10 ч. Полученныепосле ИЭФ гели извлекали из капилляров и выдерживали в течение 30 мин в буфере А.Затем разделяли белки по массам в стандартном 12%-ном ДСН-ПААГ геле в камере дляэлектрофореза Protean II xi 2-D Cell (BioRad, США), используя следующую программу(для 12 гелей одновременно): 30 мА – 20 мин, 70 мА – 2 ч, 60 мА – 4 ч. Детекцию белковосуществляли при помощи сканера флуоресценции Typhoon FLA 9500 BiomolecularImager (GE Healthcare, США). Расчет соотношений белков в образцах проводили посоотношению флуоресценции красителей Cy3 и Cy5, введенных в белки.Окрашивание гелей раствором нитрата серебра.
После проведения двумерногоэлектрофореза белки фиксировали в геле раствором Р2 (не менее 1 ч), промывали ddH2O(3 раза по 15 мин), обрабатывали раствором Na2S2O3 в воде (0,3 г/л) и снова промывалиddH2O (2-3 раза по 10 мин). Затем гели выдерживали в растворе Р3 в течение 10-15 мин,промывали ddH2O (2 раза по 30 с) и добавляли раствор Р4. Окрашивание останавливали10%-ной CH3COOH. Перед фотографированием гели промывали ddH2O.Введение радиоактивной32Р-метки на 5-конец фрагментов РНК проводилиинкубируя 60 пмоль РНК-фрагмента с 10 ед. акт. Т4-полинуклеотидкиназы (Thermo FisherSceintific, США) и 3 мкл [γ-32Р]АTP в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl (pH 7,6), 10мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ и 0,1 мМ спермидин (общий объем реакционной смеси 15 мкл).Реакцию проводили при 37ºС в течение 30 мин.
Меченые фрагменты РНК очищалиметодом гель-фильтрации на колонках G-25 Illustra MicroSpin™ (GE Healthcare, США)или с помощью электрофореза в 8%-ном ПААГ в денатурирующих условиях (7 Ммочевина) с последующей элюцией и осаждение этанолом.126Радиоактивность32Р-меченых препаратовопределялиметодом счёта поЧеренкову в импульсах в минуту на счетчике Tracor Analytic Delta 300 (ThermoQuest CEInstruments, США). Ошибка счёта не превышала 2%.Визуализацию радиоактивных полос в геле и обсчет данных проводили наприбореFujifilmFLA-3000(FujifilmMedicalSystemsInc.,США),используякомпьютерную программу Aida Image Analyzer 3.44.035.Визуализацию флуоресценции меченых флуоресцентными красителями белковпроводили на приборе Typhoon FLA 9500 Biomolecular Imager (GE Healthcare, США).ПодготовкапроббелковдляMALDIанализа.Положениесигналовфлуоресценции того или иного белка сопоставляли с фотографией ПААГ послепрокрашивания раствором соли серебра. Нужные зоны вырезали из геля с помощьюобрезанныхподиаметрубелкового«пятна»стерильныхнаконечниковдляавтоматического дозатора.
Осажденное серебро в вырезанном фрагменте растворяли всвежеприготовленном растворе Р5 (~ 10 мкл). Затем фрагмент геля промывали 100 мклCHROMASOLV H2O и 100 мкл буфера Б (2 раза по 20 мин), добавляли 100 мклацетонитрила и через 5 мин инкубации при комнатной температуре отбирали жидкость.Образцы сушили на воздухе в течение 5-10 мин, а затем добавляли 4-10 мкл растворатрипсина (0,05-0,125 мкг/мкл) в буфере В в зависимости от величины фрагмента геля иинкубировали в течение 3-4 ч при 37ºС.
Реакцию останавливали добавлениемэквимолярного количества 0,5% раствора ТФУ (V/V).Масс-спектрыMALDI-TOFбылиполученыирасшифрованыс.н.с. Серебряковой М.В. (НИИФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова) на MALDI-TOF-масс-спектрометре Ultraflex II (Bruker, Германия) в режимеположительных ионов. В качестве матрицы использовали 3-гидроксипиколиновуюкислоту и гидроцитрат диаммония. Белки определяли по наборам масс протеолитическихпептидов, последовательности которых идентифицировали с помощью базы данных USNationalCenterforBiotechnologicalInformation(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),содержащейполные геномы исследуемых штаммов B. subtilis.III.
3. Общие методикиПолучение химически компетентных клеток E. coli DH5α. Ночную культуруклеток E. coli DH5α (3 мл) разбавляли 100 мл свежей питательной среды LB ивыращивали при перемешивании 220 об./мин до достижения оптической плотностиА600 ~ 0,50,7 О.Е. Затем клеточные культуры охлаждали в бане со льдом в течение 5 мин127и центрифугировали (5 мин, 4000 об./мин, 4°С) для осаждения клеток. Клеточнуюбиомассу ресуспендировали в 30 мл охлажденного (4°С) раствора 100 мМ CaCl2,инкубировали 5 мин в бане со льдом и повторно центрифугировали.
Осадокресуспендировали в 3 мл раствора 75 мМ CaCl2, содержащего 25% (V/V) глицерина,отбирали аликвоты объемом 50 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили притемпературе -70°C.Трансформация плазмид в клетки E. coli DH5 методом теплового шока.Химически компетентные клетки E. coli DH5 (50 мкл) размораживали в бане со льдом,добавляли 5 мкл реакционной смеси после лигирования ДНК или 20 нг очищеннойплазмиды и инкубировали при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки подвергали тепловомушоку (30 с, 42°С) и вновь инкубировали в бане со льдом в течение 2 мин. Последобавления 600 мкл свежей питательной среды LB и культивирования 1 ч при 37°Саликвоту клеточной суспензии объемом 100 мкл наносили на чашку Петри с LB-агаром,содержащим 100 мкг/мл ампициллина и выращивали при 37°С в течение 18 ч дляпоследующей селекции трансформированных клеточных колоний.Выращивание клеток B.
subtilis 168, PY79, dbsrA, dbsrB, dbsrAB, dbsrAB+A иdbsrAB+B для построения кривых клеточного роста и выделения общей РНК.Аликвоты ночных культур клеток B. subtilis (А600 ~ 4-5 О.Е.), выращенных в присутствиинеобходимых антибиотиков (кроме клеток дикого типа, см. табл. 1) разбавляли 500 млсвежей питательной среды LB до А600 ~ 0,02 О.Е. и культивировали при 37°C (220об./мин) в отсутствие антибиотиков в течение 48 ч.
Через промежутки времени 3, 4,5, 6,10, 24, 36 и 48 ч отбирали аликвоты объемом 25 мл. Для моделирования стадии выхода изстационарной фазы аликвоту клеточной культуры объемом 20 мл после 24 ч выращиванияразбавляли 80 мл свежей питательной среды LB и культивировали при 37°C (220 об./мин)в течение 5 мин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
