Малые некодирующие 6S-1 и 6S-2 РНК из Bacillussubtilis - сравнительный анализ свойств и функций (1105586), страница 30
Текст из файла (страница 30)
акт. Taq-полимеразы.Таблица III.4. Праймеры для ПЦР фрагментов ДНК, содержащих промоторы модельныхгенов B. subtilis.ФрагментДНКrrnBvegrrnOtufargCappDcspBC2 phi29Направлениепраймеров*FПраймеры**(олигодезоксирибонуклеотиды)Температура«отжига», оС5'-GACAAGCTTACACACGCTTTAGAAATCATGG-3′R5′-GACGTCGACGATCATTTCGTTACTTCTCAATG-3′F5'-CATAATTTACCGAAACTTGCG G-3'R5'-CAGAAGGGTACGTCTCAGC -3'F5'-GAAGAGCATGTTGCTACAGTAGC-3'R3'-GTGTGACCTGCGTCGTGCAG-5'F5'-ATCACTACGGAGAAGTGCCG-3'R5'-CATGTGATTTGGAACGGTCG-3'F5'-TTGAGCGGAATTCCCATTGAAC-3'R5'-CCGCTGGATGAATAAAGTATGC-3'F5'-TGTCCATTCCTGCTGAGACC-3'R5'-TCCGTCAACCGCAGGGATC-3'F5'-GCAAACGTATGATCACATATCG-3'R5'-AAGCCTTCGCCTTGAATAGC-3'F5'-CTGTGTTTGTGTTGATGATGTC-3'R5'-GGCGCTTTAAAGTAGGGTACAGCGACAAC-3'6256625660585658* F – «прямой» праймер (от англ.
«forward»), R – «обратный» праймер (от англ. «reverse»)** Индекс d (дезокси) опущен. Праймеры к фрагментам ДНК argC, C2 phi29 и cspB синтезированыкомпанией Integrated DNA Technologies (США); остальные праймеры синтезированы с.н.с. Романовой Е.А.(НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова).Реакцию проводили в приборе для амплификации Eppendorf Mastercycler personal(Eppendorf North America, США). В зависимости от температуры «отжига» праймеровиспользовали различные условия проведения ПЦР.
Представленный цикл ПЦР (табл.III.5) повторялся 25 раз.Таблица III.5. Условия проведения ПЦР. Стандартный цикл.СтадияТемпература, оСВремя, с«Плавление» ДНК9460«Отжиг» праймеровсогласно данным в табл. 860Элонгация7240После ПЦР реакционные смеси объединяли, отбирали аликвоты, в которыедобавляли 6-кратный раствор для нанесения в гель Orange Loading Dye (Thermo FisherScientific, США) и анализировали методом электрофорез в 1%-ном агарозном геле137(содержащем 0,5мкг/мл (m/V) бромистого этидия) с последующей визуализацией полоспод УФ-светом (рис.
III.3). Длину ДНК-продуктов (табл. III.6) оценивали по подвижностив геле соответствующих ДНК-маркеров. Как видно из рис. III.3 ПЦР во всех случаяхпроходит эффективно без побочных продуктов реакции, а длины полученных ДНКфрагментов соответствуют рассчитанным. Очистку фрагментов ДНК после ПЦРпроводили с помощью коммерческого набора Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System(«Promega», США) по стандартному протоколу.Рис. III.3. Анализ продуктов ПЦР. Фотография под УФ-светом 1%-ного агарозного геля,окрашенного раствором этидия бромида.
Дорожка 1 – ДНК-маркер (длина фрагментов (н.п.)указана слева).Таблица III.6. Значения длин ПЦР-фрагментов ДНК и предполагаемых РНК-транскриптовдля промоторов различных генов, используемых для изучения ингибирования транскрипции.ГенДлинаДНК, н.п.argC234appD310cspB370C2φ29268tuf221rrnO386rrnB244veg288Транскрипция in vitro. 1 пмоль очищенных фрагментов ДНК (ф. к. 100 нМ),смешивали с 2 мкл буфера LM и 0,6 мкл холофермента σA-РНКП (0,7 мкг/мкл) иинкубировали в объеме 6 мкл 10 мин при 37°C для образования комплекса ДНК:РНКП.Затем добавляли различные количества 6S-1 РНК, 6S-2 РНК или РНК РНКазы P B. subtilis(409 н.о., получена с помощью Т7-транскрипции) в объеме 2 мкл и инкубировали еще 10мин при 37°C для установления равновесия между комплексами РНК:РНКП иДНК:РНКП.Транскрипциюначиналидобавлением2мклсмесиизчетырехрибонуклеозидтрифосфатов: ATP, CTP, GTP (Ф.
к. 50 или 200 мкМ каждого), UTP (Ф. к.13812,5 или 50 мкМ), содержащей 0,5 мкКи [-32P]UТP (4000 Ки/ммоль), и инкубировали 20мин при 37°C. Конечная концентрация σA-РНКП составляла примерно 100 нМ;концентрации 6S-1, 6S-2 или РНК РНКазы P: 0,2, 0,5, 1, 2 или 5 мкM. Реакциюостанавливали добавлением 10 мкл двукратного раствора для нанесения в гель RNALoading Dye (Thermo Fisher Scientific, США). Смесь прогревали 5 мин при 95°C (дляденатурации РНКП и разрушения вторичных структур РНК) и немедленно замораживали.Продукты транскрипции анализировали методом электрофореза в 5%-ном ПААГ,содержащем 7 М мочевину при напряженности поля 5 В/см в однократном TBE-буфере.Ренатурация 6S-1 и 6S-2 РНК и формирование комплексов с синтетическимипРНК.
Растворы 0,1-5 мкМ 6S-1 или 6S-2 РНК в буфере ТЕ нагревали до 95°C иинкубировали в течение 5 мин (объем реакционной смеси составлял 4-8 мкл), а затемступенчато охлаждали, инкубируя каждые 5 мин при 80, 70, 60, 50 и 37°C. Дляформирования комплексов 6S-1 или 6S-2 РНК с синтетическими пРНК (табл. III.7)процедуруренатурациипроводиливприсутствии2-10-кратныхизбытковолигорибонуклеотида.Таблица III.7.
Олигорибонуклеотиды – аналоги пРНК, использованные в работе.НазваниеНуклеотидная последовательностьПроизводитель*р86S-15'-GUUCGGUC-3'IDTр126S-15'-GUUCGGUCAAAA-3'IDTр136S-15'-GUUCGGUCAAAAC-3'IDTр146S-15'-GUUCGGUCAAAACU-3'р206S-15'-GUUCGGUCAAAACUAGGUGU-3'р126S-25'-AAAGGUUAAAAC-3'р136S-25'-AAAGGUUAAAACU-3'МГУр146S-25'-AAAGGUUAAAACUU-3'МГУр156S-25'-AAAGGUUAAAACUUA-3'IDTр166S-25'-AAAGGUUAAAACUUAA-3'МГУр206S-25'-AAAGGUUAAAACUUAAUUCA-3'МГУNoxxonМГУNoxxon* IDT: Integrated DNA Technologies, США; Noxxon: Noxxon Pharma GmbH, Германия; МГУ:синтезированы с.н.с. кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ имениМ.В. Ломоносова Зацепиным Т.С.Комплексообразование 6S-1 и 6S-2 РНК с РНКП. 6S-1 или 6S-2 РНК (0,1-2 мкМ)после процедуры ренатурации смешивали с 2 мкл 5-кратного буфера LM, содержащего0,5 мкг/мкл гепарина, и 0,5-2 мкл препарата РНКП (Ф.
к. 0,05-3 мкМ), выделенного поМетодике 3. Реакционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37°C, добавляли2 мкл 10%-ного раствора глицерина или 2 мкл 6-кратного раствора для нанесения в гель139DNA Loading Dye (Thermo Fisher Sceintific, США) и наносили на 5-, 7,5- или 15%-ныйПААГ (1×TBE). Затем проводили электрофорез в течении 3-8 ч при напряженности поля5 В/см. Гели низкой процентности (5%- и 7,5%-ные) перед авторадиографиейвысушивали.Комплексообразование 6S-1 и 6S-2 РНК с РНКП в присутствии смесинуклеозидтрифосфатов. 6S-1 или 6S-2 РНК (1 мкМ) после процедуры ренатурациисмешивали с 2 мкл 5-кратного буфера LM, содержащего 0,2 мкг/мкл гепарина, и 1 мклпрепарата РНКП (ф.
к. 2 мкМ), выделенного по Методике 3. Реакционные смесиинкубировали 30-180 мин при 37°C, а затем добавляли 2 мкл смеси четырехнуклеозидтрифосфатов (1 мМ каждого) и дополнительно инкубировали в течение1-180 мин. Перед нанесением в 7,5%-ный ПААГ в реакционные смеси добавляли 2 мкл6-кратного раствора для нанесения в гель DNA Loading Dye (Thermo Fisher Sceintific,США).КомплексообразованиеРНКПспредварительносформированнымидуплексами между 6S-1/6S-2 РНК и синтетическими пРНК.
6S-1 или 6S-2 РНК (1 мкМ)после процедуры ренатурации в присутствии 2 мкМ или 10 мкМ синтетическихолигорибонуклеотидов разной длины смешивали с 2 мкл 5-кратного буфера LM,содержащего 0,5 мкг/мкл гепарина, и 1 мкл препарата РНКП (ф. к. 2 мкМ), выделенногопо Методике 3. Реакционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37°C, смешивалис 2 мкл 6-кратного раствора для нанесения в гель DNA Loading Dye (Thermo FisherSceintific, США) и анализировали методом электрофореза в 7,5- или 15%-номПААГ (1×TBE).Транскрипция de novo пРНК с матрицы 6S-1 или 6S-2 РНК. 6S-1 или 6S-2 РНК(1-5 мкМ) после процедуры ренатурации в отсутствие или в присутствии синтетическихолигорибонуклеотидов разной длины (10 мкМ) смешивали с 2 мкл 5-кратного буфера LM,содержащего 0,5 мкг/мкл гепарина, и 1 мкл препарата РНКП (ф.
к. 2 мкМ), выделенногопо Методике 3. Реакционные смеси инкубировали в течение 30 мин при 37°C, а затемначинали транскрипцию добавлением 2 мкл смеси из четырех нуклеозидтрифосфатов (1мМ каждого, Ф. к. 200 мкМ, если не указано иное), содержащей 0,5 мкКи [γ-32P]RTP (гдеR = A, G) или [α-32P]NTP (3000 мкКи/ммоль). После инкубации при 37°C в течение 1 чреакционные смеси анализировали методом электрофореза в 25%-ном ПААГ. Переднанесением на гель образцы смешивали с эквивалентным объемом раствора P1 иинкубировали 5 мин при 95°C (для денатурации РНКП и разрушения комплексов 6SРНК:пРНК) с последующим быстрым охлаждением в бане со льдом.140Синтез фрагментов ДНК, содержащих антисмысловые последовательностигенов 6S-1, 6S-2 и 5S РНК B.
subtilis под контролем Т7-промотора. Для синтеза РНКзондов к 6S-1, 6S-2 и 5S РНК B. subtilis необходимо было получить фрагменты ДНК, вкоторых Т7-промотор располагался перед антисенсовой цепью соответствующих генов.Для этого использовали набор праймеров, перечисленный в табл.
III.8.Таблица III.8. Праймеры для ПЦР фрагментов ДНК, содержащих гены bsrA, bsrB иизмененной направленности.Название*Праймеры**(олигодезоксирибонуклеотиды)bsrA_inv_F5'-AAGGGAAATAAAGTCCTGATGTGTTAGTTG-3'bsrA_inv_R5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAAGTCCCAATAGTGCCGTTG-3'bsrB_inv_F5'-GAAGCTACTTTGTGCGTATTGTTAATTAAG-3'brsB_inv_R5'-TAATACGACTCACTATAGGGTTTCCGAAAAGGAAATGGCTTT-3'5S_inv_F5'-AGAGGTCACACCCGTTCCCAT-3'5S_inv_R5'-TAATACGACTCACTATAGGGGGCGGCGTCCTACTCTCA-3'* F – «прямой» праймер (от англ.
«forward»), R – «обратный» праймер (от англ. «reverse»). Индекс d(дезокси) при написании последовательностей ДНК опущен.** Последовательность Т7-промотора выделена жирным курсивом.В качестве матрицы для синтеза ДНК-фрагментов использовали геномную ДНКB. subtilis 168. ПЦР проводили по стандартному протоколу (95°С 60 c, 54°С – 60 с, 72°С– 40 с, цикл повторяли 25 раз). Реакционные смеси анализировали с помощьюэлектрофореза в 1%-ном агарозном геле (1×TBE) и проводили выделение и очисткуцелевых ДНК с помощью коммерческого набора QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen,Нидерланды).Получение DIG-меченных зондов для детекции фрагментов РНК методом блотгибридизации. Детекцию 6S-1, 6S-2 и 5S РНК B.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
