Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 20
Текст из файла (страница 20)
При определенных соотношениях силоксан:ПФС происходитзначительное понижение аффинности и увеличение кажущейся константыМихаэлиса в 30 раз по сравнению с электронейтральными силоксановымимембранами. Абсолютный максимум значения константы наблюдается прииспользовании смеси 3 % силоксана и 5 % ПФС, кажущаяся константа Михаэлисафермента в таком случае достигает 10 мМ. Как ожидалось, диапазон определяемыхконцентраций лактата при использовании биосенсора на основе данной мембранысдвинут в область высоких значений и составляет в batch-режиме 0.1 - 80 мМ (табл.8), что полностью покрывает физиологическое содержание лактата в поте.Таким образом, при иммобилизации лактатоксидазы в смешанные мембранысилоксана и перфторсульфонированного полимера наблюдается понижениесродства фермента к субстрату и значительное увеличение кажущейся константыМихаэлиса вплоть до 10 мМ и, благодаря этому, сдвиг диапазона определяемыхконцентраций на два порядка в область высоких значений.8.7.Аналитические характеристики биосенсора для определениявысоких содержаний лактатаОтклик биосенсора на основе смешанной мембраны (3 % силоксана и 5 %ПФС) при определении лактата в batch-режиме представлен на рис.
65,наблюдаютсямаленькиезначенияфоновыхтоков,перваяопределяемаяконцентрация четко различима. Видно, что отклик стабилен, значения тока неуменьшаются, а даже немного растут со временем, а также видны требуемыесоотношения между исследуемыми концентрациями. Биосенсор тестировали сиспользованием модельных растворов лактата трехкратно, на основании чегостроили градуировочную зависимость, которая приведена на рис.
66.129 -0.2I, мкА-0.4-0.603006009001200время, сРис. 65. Отклик биосенсора при определении лактата в batch-режиме припостроении градуировочной зависимости. Смесь для иммобилизации ферментасодержала 3% силоксана и 5% перфторсульфонированного полимера. Буферныйраствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.12184-210j, мкАсмj, мкАсм-21000,1Слактата, M0.0-610-510-410-3105.0x10-210-31.0x10-2-110Слактата, MРис. 66. Градуировочные графики для определения лактата в batch-режиме припостоянном перемешивании. Буферный раствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН6.0), потенциал 0.00 В.
Смесь для иммобилизации фермента содержала:- 1.5%силоксана, - 3 % силоксана и 5% перфторсульфонированного полимера (n = 3, P =0.95).130Нарис.66краснымцветомприведенградуировочныйграфикразработанного биосенсора на лактат, для примера черным цветом показанаградуировочная зависимость лактатного биосенсора с силоксановой мембраной.Видно, что произошел сдвиг диапазона определяемых концентраций лактата на двапорядка относительно биосенсора на основе электронейтральных силоксановыхмембран. Эмпирические данные представляют собой ветвь гиперболы, на вставкепоказана начальная часть градуировочной зависимости для биосенсора, с составомиммобилизующей смеси 3% силоксана и 5% ПФС, которая хорошо описываетсялинейной функцией.Диапазон определяемых концентраций лактата в batch-режиме составляетпочти 3 порядка от 1·10-4 до 8·10-2 М, предел обнаружения - 7∙10-5 М лактата, времяотклика 60 с.
Коэффициент чувствительности биосенсора, измеряемый как тангенсугланаклонаначальнойчастиградуировочнойзависимости,равен1.13 мA∙M-1∙см-2.Стоит заметить, что Kм составляет 10.4 мМ, то есть константа увеличилась в30 раз за счет использования смешанных мембран для иммобилизации фермента.Второй субстрат ферментативной реакции – кислород, как известно,концентрация молекулярного кислорода в буферном растворе при нормальныхусловиях составляет 0.25 мМ, то есть, определение лактата выше даннойконцентрации затрудняется, тем не менее, в данной работе удалось достигнутьсодержания в 80 мМ в batch-режиме. В проточно-инжекционном анализепроисходит непрерывное обогащение системы кислородом за счет постоянногопрокачивания раствора буферачерезячейку, в системе ПИА диапазонопределяемых концентраций шире.
Разработанный биосенсор был протестирован всистеме ПИА и продемонстрировал диапазон определяемых концентраций лактатапочти 5 порядков 1·10-5 - 5·10-1 M, предел обнаружения - 1·10-5 М лактата,коэффициент чувствительности 0.77 мA·M-1·cм-2, максимальное время отклика – 2мин. Как видно на рис. 67, наблюдается ровный стабильный фоновый отклик смаленькими значениями токов. Отчетливо видны требуемые соотношения междуисследуемыми концентрациями, что наглядно показано на градуировочномграфике на рис.
68.1310.0510-5-5510110 110-4I, мкA-0.1-4-3110 510-3110-2-0.2510-2110-1-0.3510-0.4500100015002000-12500время, сРис. 67. Отклик биосенсора при определении лактата в системе проточноинжекционного анализа. Смесь для иммобилизации фермента содержала 3%силоксана и 5% перфторсульфонированного полимера. Буферный раствор 0.1 MKCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.-2101.010.5j, мкАсмj, мкАсм-2100Слактата, мM0.00.51.00,1-610-510-410-310-210-110010Слактата, MРис. 68. Градуировочные графики для определения лактата в системе ПИА.Буферный раствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.
Смесь дляиммобилизации фермента содержала:- 1.5% силоксана,перфторсульфонированного полимера (n = 3, P = 0.95).- 3 % силоксана и 5%132Градуировочный график разработанного биосенсора на лактат представленна рис. 68 красным цветом, черным цветом приведена градуировочная зависимостьдля биосенсора на основе силоксановой мембраны. На вставке - начальная частьградуировочной зависимости для биосенсора со смешанной мембраной. Видно, чтодиапазон определяемых концентраций лактата сдвинут в область высоких значенийна два порядка и увеличен на один порядок относительно биосенсора на основесилоксановой мембраны.Для определения операционной стабильности биосенсора были проведеныэксперименты в batch-режиме при постоянном перемешивании в растворе 2.5 мМлактата,чтоявляетсядовольножесткимиусловиями,таккакпродуктвосстановления H2O2 – гидроксил-ионы – растворяют берлинскую лазурь [200], ичем концентрированнее раствор лактата, тем больше образуется пероксидаводорода, и тем быстрее смывается покрытие пленок БЛ.
Как видно на рис. 69,первые 3 ч работы биосенсор сохраняет 100% отклика, далее, в течение следующих5 ч, сенсор теряет около 10% от первоначального сигнала в час. Потеря половинысигнала от первоначальной активности наблюдается только спустя 9 чнепрерывной работы, что представляет собой очень высокую операционнуюстабильность, даже в сравнении с биосенсорами на основе силоксановых мембран,где наиболее стабильный датчик терял 50% отклика спустя 5 ч работы.
Такимобразом, стабильность биосенсора улучшена вдвое, что позволяет проводитьдлительные эксперименты без потери активности. Данный факт заслуживаетвнимания, так как при создании данного биосенсора удалось добитьсязначительного понижения аффинности фермента к субстрату, что подразумеваетухудшение аналитических характеристик, однако в нашем случае биосенсордемонстрирует не только расширение диапазона определяемых концентрацийлактата, но и повышение операционной стабильности.Профессиональные высокоинтенсивные физические нагрузки, в процессекоторых необходимо измерять лактат, занимают 2 - 3 часа, таким образом, спомощью разработанного биосенсора можно непрерывно мониторировать аналитбез какой-либо потери значения отклика.Также была протестирована стабильность биосенсора при хранении, дляэтого запечатанные в конверты образцы хранились 3 мес в холодильной камере при133+4ºС.
Градуировочная зависимость биосенсора для определения лактата в batchрежиме приведена на рис. 70, на вставке показана начальная часть графика, покоторой рассчитывался коэффициент чувствительности датчика.j, мкАсм-2161284021618время, чРис. 69. Операционная стабильность биосенсора при определении лактата в batchрежиме при постоянном перемешивании раствора 2.5 мМ лактата (смесь дляиммобилизации содержала 3% силоксана и 5% ПФС). Буферный раствор 0.1 MKCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.3-21.511.0j, мкА смj, мкАсм-22Cлактата, мМ0.50.3-410-3100.60.9-210Слактата, МРис.
70. Градуировочный график для определения лактата в batch-режиме приперемешивании с помощью биосенсора после хранения датчика в течение 3 мес134(смесь для иммобилизации содержала 3% силоксана и 5% ПФС). Буферныйраствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В, (n = 3, P = 0.95).Коэффициент чувствительности биосенсоров после длительного хранения,рассчитанный как тангенс угла наклона начальной части градуировочнойзависимости, составил 1.0 ± 0.5 мA·M-1·cм-2 (n = 3, P = 0.95), а диапазонопределяемых концентраций лактата в batch-режиме почти три порядка от 1·10-4 до5·10-2 М.
Из чего можно сделать вывод, что даже спустя 3 мес хранениябиосенсоры стабильно работают и не теряют чувствительности. Данный фактпредставляет большой интерес, особенно ввиду того, что фермент лактатоксидазаявляется одной из наиболее лабильных оксидаз и создание условий длядлительного сохранения ее активности является сложной задачей, особенно сучетом того, что было достигнуто значительное понижение сродства фермента ксубстрату. Однако в нашем случае сохраняется широкий диапазон определяемыхконцентраций лактата, высокая чувствительность и длительная операционнаястабильность и стабильность при хранении.Таким образом, путем понижения сродства фермента к субстрату, удалосьдостичь сдвига диапазона определяемых концентраций лактатного биосенсора вобласть высоких значений.
Создан лактатный биосенсор, характеризующийсядиапазономопределяемыхконцентрацийпочти5порядков,высокойчувствительностью и длительной операционной стабильностью. Первые 3 чизмерений биосенсор стабильно работает и сохраняет первоначальное значениеотклика, при хранении биосенсор не теряет чувствительности в течение, покрайней мере, 3 мес.
Совокупность всех вышеперечисленных характеристикпозволяет использовать созданный биосенсор для анализа неразбавленного пота исоздания неинвазивного монитора состояния гипоксии.135Глава 9. Создание неинвазивного монитора состояния гипоксии9.1.Модельная проточная тонкослойная ячейка со встроеннымбиосенсором для определения лактатаНеинвазивное определение лактата предусматривало создание монитора,фиксируемого на поверхности кожи, проводящего всасывание выделяемого пота инепрерывное определение лактата в нем. Для этого было необходимо создатьячейку со встроенным лактатным биосенсором на высокие (миллимолярные)концентрации лактата. Так как количество выделяемого пота обычно крайне мало,то была поставлена задача разработать систему для анализа малых объемов пробы,для чего на поверхности лактатного биосенсора был сконструирован капилляр.При первоначальном рассмотрении была создана ячейка, моделирующаянеинвазивныймонитор,проводящаяизмерениявсистемепроточно-инжекционного анализа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
