Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 21

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 21)

Для активации выделения пота у добровольцев всостоянии покоя использовался электрофорез с пилокарпином, при физическойнагрузке пот выделялся самопроизвольно. Для сбора пота с целью анализа вмодельной ячейке использовался коммерчески доступный потосборник Macroduct,приведенный на рис. 71. Потосборник прикладывали к поверхности кожи (обычнона ноге или руке добровольца в области работающей мышцы) и крепилиэластичным жгутом, после чего в течение 20 – 50 мин производилось всасываниепота в капилляр, а затем жидкость извлекали при помощи пипетки.Рис.

71. Коммерчески доступный потосборник Macroduct.136Потосборник с одной стороны содержит длинный капилляр, а с другойнебольшое конусообразное углубление, которое при сборе пота прилегает кповерхности кожи и пот самопроизвольно всасывается в капилляр. Конструкциясистемы сбора пота Macroduct запатентована в США и в Англии. Потосборникиспользуется для сбора пота у новорожденных при диагностике врожденногозаболевания муковисцидоза (кистозного фиброза) по проводимости.Прототип монитора для анализа пота представлял собой параллелепипед изорганического стекла с отверстием для штутсера, переходящим в тонкий капилляр,как видно на рис. 72. Встроенный в модельную ячейку биосенсор представлялсобой планарный электрод, модифицированный БЛ с иммобилизованнымферментом ЛОД в смешанную мембрану (смесь для иммобилизации ферментасодержала 3% силоксана и 5% ПФС), как обладающий наиболее широкимдиапазоном определяемых концентраций лактата вплоть до 0.5 М в системе ПИА идлительной операционной стабильностью по итогам § 8.Биосенсор приклеивали к ячейке таким образом, чтобы незаклееннаяповерхность содержала часть вспомогательного электрода, рабочего и электродасравнения, как показано на рис.

73, оставшуюся липкую часть ячейки герметичнозаклеивали пластиком, края обрабатывали герметиком и высушивали. После того,какгерметиквысыхал,системуподключалисоднойстороныкперистальтическому насосу, а с другой к потенциостату и проводили измерение,фотография ячейки в процессе работы приведена на рис. 74.Рис. 72. Фотография модельной тонкослойной ячейки со встроенным биосенсоромдля определения лактата.137Рис.

73. Схема тонкослойной ячейки.Рис. 74. Фотография модельной проточной тонкослойной ячейки в процессеизмерения.Для построения градуировочной зависимости через перистальтический насоспрокачивали буферный раствор (рН 6.0) и ждали выхода на стационарный уровень.Далее, после установления фонового значения тока, прокачиваемый растворменяли на лактат 1∙10-4 М, приготовленный с использованием буферного раствора(рН 6.0), затем 5∙10-4 М и так далее до 0.1 М раствора. Отклик биосенсора приведенна рис.

75, видны маленькие значения фоновых токов, первая определяемаяконцентрация четко различима. Наблюдается стабильность оклика, значения токане уменьшаются, а даже немного растут со временем. Отклик биосенсора с138использованием модельных растворов лактата повторяли трехкратно, на основаниичего строили градуировочную зависимость. Как видно на градуировочном графикена рис. 76, наблюдаются требуемые соотношениямежду исследуемымиконцентрациями лактата.-4110-0.1-4510-3I, мкА110-0.2-3510-2110-0.3-2510300400500600700время, сРис. 75. Отклик биосенсора при определении лактата в модельной проточнойячейке (смесь для иммобилизации фермента содержала 3% силоксана и 5% ПФС).Буферный раствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.613j, мкА см -2j, мкАсм-210Слактата, M-30.05.0x10-21.0x100.1-410-310-210-110Слактата, MРис.

76. Градуировочный график для определения лактата в модельной проточнойячейке (смесь для иммобилизации содержала 3% силоксана и 5% ПФС). Буферныйраствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В, (n = 3, P = 0.95).139Вмодельнойпроточнойячейкебиосенсорпродемонстрироваланалитические характеристики, не уступающие стандартной амперометрическойячейке (§ 8.7). Диапазон определяемых концентраций лактата составил 1∙10-4 5∙10-2 М, коэффициент чувствительности 0.8 ± 0.3 мA·M-1·cм-2 (n = 3, P = 0.95).Прототип монитора для определения лактата в поте довольно прост виспользовании, с помощью него были проведены измерения лактата в поте всостоянии покоя и при физической нагрузке у добровольцев, результатыпредставлены в табл.

9.Таблица 9. Концентрация лактата в отобранных образцах пота (n = 2, P = 0.95)СостояниеОбразецС(лактата), мМВ состоянии18±2покоя216 ± 2313 ± 3В процессе452 ± 5физической518 ± 2нагрузки638 ± 2Полученные результаты по концентрации лактата в поте в состоянии покоя ив процессе тренировок полностью согласуются с литературными данными [11, 8487].Таким образом, путем интеграции лактатного биосенсора и тонкослойнойячейки, был разработан прототип неинвазивного монитора.

Продемонстрированширокий диапазон определяемых концентраций лактата, достаточный дляопределения лактата в поте не только в состоянии покоя, но и в процессефизических нагрузок. Прототип апробирован для определения лактата в пробахпота, что позволяет его использовать в качестве базы при создании неинвазивногомонитора состояния гипоксии.9.2.Создание неинвазивного монитора состояния гипоксииДля разработки неинвазивного монитора состояния гипоксии, проводящегоизмерения лактата в поте в процессе реального времени, модельная проточнаяячейка со встроенным лактатным биосенсором была модифицирована. А именно, в140конструкцию ячейки вместо соединения с системой ПИА было добавленоконусообразное углубление, форма которого была взята с коммерчески доступногопотосборника (рис.

71). Сторона ячейки, содержащая конус, была предназначенадля непосредственного контакта с поверхностью кожи, всасывания пота идальнейшего прохождения его по капилляру, как показано на рис. 77. Встроенныйвнеинвазивныймониторбиосенсорпредставлялсобойпланарнуютрехэлектродную структуру с рабочим электродом, модифицированным БЛ симмобилизованным ферментом ЛОД в смесь, содержащую 3% силоксана и 5%ПФС.Рис. 77. Схема работы неинвазивного монитора.Передизмерениемпотаэлектродпредварительноградуировалисиспользованием стандартных растворов лактата.

Для выхода на стационарный141уровень в область конусообразного углубления на монитор наносили несколькокапель буферного раствора, которые самопроизвольно всасывались и заполняликапилляр, после чего наблюдали фоновые значения токов. Затем наносилирастворы лактата, приготовленные с использованием буферного раствора (рН 6.0),иногда требовалось прислонять ячейку к поверхности кожи для лучшеговсасывания. Также градуирование проводили вторым способом, для этого послевыхода на стационарный уровень для ввода стандартных растворов лактатаиспользовали шприц, очень медленно и аккуратно вводя растворы в капилляр.На рис. 78 показан отклик биосенсора в системе неинвазивного мониторапри построении градуировочной зависимости, наблюдаются маленькие значенияфоновых токов, первая определяемая концентрация четко различима и не сливаетсяс базовой линией. Отклик стабилен, значения тока не уменьшаются, а даженемного растут со временем.

Отклик биосенсора с использованием модельныхрастворов лактата воспроизводили трехкратно и, на основании полученныхданных, строили градуировочную зависимость (рис. 79).-41100.0-4510-3110I, мкА-0.1-0.2-3510-0.3-2110-2510-0.4-2810-0.55001000150020002500время, сРис. 78. Отклик биосенсора при определении лактата в системе неинвазивногомонитора при построении градуировочной зависимости (смесь для иммобилизациифермента содержала 3% силоксана и 5% ПФС).

Буферный раствор 0.1 M KCl,0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.142961j, мкА смj, мкАсм-2-2103Слактата, мM0-4-3102-2104-11010Слактата, MРис. 79. Градуировочный график для определения лактата в системе неинвазивногомонитора (смесь для иммобилизации содержала 3% силоксана и 5% ПФС).Буферный раствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В (n = 3, P =0.95).Наградуировочномграфикевидно,чтодиапазонопределяемыхконцентраций биосенсора на лактат в системе неинвазивного монитора составил0.1 – 80 мМ, что полностью покрывает физиологическое содержание лактата в потевсостояниипокояивпроцессефизическихнагрузок.Коэффициентчувствительности биосенсора, определяемый как тангенс угла наклона начальнойчасти градуировочной зависимости - 1.6 ± 0.5 мA·M-1·cм-2 (n = 4, P = 0.95).После проведения градуировки капилляр промывали избытком воды исушили в холодильной камере при +4°С.Таким образом, создан неинвазивный монитор для определения лактата.Диапазонопределяемыхконцентрацийлактатаполностьюпокрываетфизиологическое содержание аналита в поте, как в состоянии покоя, так и впроцессе интенсивных физических нагрузок, а значение чувствительности выше,чемприанализевамперометрической ячейки.batch-режимеиприиспользованиипроточной1439.3.Непрерывный мониторинг лактата в поте в состоянии покоя и впроцессе физической нагрузкиДля определения лактата в поте в режиме реального времени проводиласьактивация выделения пота при помощи электрофореза с пилокарпином, еслиизмеренияпроводилисьпослефизическойнагрузки,потвыделялсясамопроизвольно без использования активации.

Характеристики

Список файлов диссертации