Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559)
Текст из файла
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М.В. ЛОМОНОСОВАХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиПрибиль Медея МихайловнаВысокоэффективные лактатные биосенсоры наоснове инженерии иммобилизованнойлактатоксидазы02.00.02 – аналитическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:д.х.н., профессор Карякин А.А.Москва – 20152СОДЕРЖАНИЕСПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................. 4ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................................................................
5ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................................................... 12Глава 1. Лактат ...................................................................................................................................... 121.1.Актуальность определения лактата......................................................................................
121.2.Методы определения лактата ................................................................................................ 141.3.Неинвазивный мониторинг лактата ...................................................................................... 22Глава 2. Электрохимические биосенсоры .......................................................................................... 262.1.Принцип действия и классификация биосенсоров ................................................................. 262.2.Амперометрические биосенсоры для определения лактата ................................................ 28Глава 3.
Электрокатализаторы окисления и восстановления пероксида водорода ........................ 323.1. Физико-химические характеристики электрокатализаторов окисления ивосстановления пероксида водорода .................................................................................................. 323.2.Берлинская лазурь......................................................................................................................
343.3.Использование берлинской лазури для создания биосенсоров первого поколения .............. 36Глава 4. Иммобилизация ферментов при конструировании биосенсоров ...................................... 384.1.Методы иммобилизации ферментов ...................................................................................... 384.2.Иммобилизация лактатоксидазы ...........................................................................................
394.3.Мембраны на основе силоксанов ............................................................................................. 424.4.Мембраны на основе нафиона ................................................................................................. 45Глава 5. Сканирующая электрохимическая микроскопия ................................................................ 475.1.Общие сведения .........................................................................................................................
475.2.Принцип работы сканирующего электрохимического микроскопа ..................................... 485.3. Гибкие планарные микроэлектроды в качестве зондов для сканирующейэлектрохимической микроскопии ........................................................................................................ 48Глава 6. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..................................................................................................... 536.1.Материалы ................................................................................................................................ 536.2.Оборудование............................................................................................................................. 546.3.Методы ......................................................................................................................................
60РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ............................................................................................................... 73Глава 7. Высокочувствительный биосенсор для определения лактата на основе лактатоксидазыи мембран с использованием силоксана ............................................................................................. 737.1.Получение электродов, модифицированных берлинской лазурью ........................................
737.2. Использование силоксана для иммобилизации фермента на поверхность планарныхэлектродов, модифицированных берлинской лазурью ...................................................................... 777.3. Использование сканирующей электрохимической микроскопии для скринингаферментсодержащих мембран различного состава ........................................................................
7937.3.1. Изготовление гибких планарных микроэлектродов и модификация их берлинскойлазурью807.3.2. Аналитические характеристики микросенсоров для определения пероксида водородав качестве зондов для сканирующей электрохимической микроскопии827.3.3. Получение изображения ферментсодержащей мембраны с использованиемсканирующего электрохимического микроскопа847.3.4.
Получениетрехмерногоизображенияферментсодержащихмембрансиспользованием сканирующего электрохимического микроскопа907.4. Лактатные биосенсоры на основе ферментсодержащих силоксановых мембранразличной плотности ........................................................................................................................... 957.5. Использование методов сканирующей электронной и лазерной микроскопии ипрофилометра для исследования ферментсодержащих мембран ................................................
1007.6. Аналитические характеристики высокочувствительного биосенсора для определениялактата ............................................................................................................................................... 105Глава 8. Биосенсор для определения высоких (миллимолярных) концентраций лактата ...........
1128.1.Методы сдвига диапазона определяемых концентраций в область высоких значений .. 1128.2. Использование перфторсульфонированного полимера для иммобилизациилактатоксидазы при создании биосенсоров для определения лактата ....................................... 1138.3. Скрининг различных составов ферментсодержащих мембран с использованиемсканирующей электрохимической микроскопии ..............................................................................
1158.4.Линейные сканирования двух ферментсодержащих мембран в растворах лактата ..... 1198.5. Сканирование четырех проб лактатоксидазы в смешанных мембранах методомсканирующей электрохимической микроскопии ..............................................................................
1208.6. Использование смешанных мембран для иммобилизации лактатоксидазы при созданиилактатных биосенсоров..................................................................................................................... 1238.7. Аналитические характеристики биосенсора для определения высоких содержанийлактата ............................................................................................................................................... 128Глава 9.
Создание неинвазивного монитора состояния гипоксии ................................................. 1359.1. Модельная проточная тонкослойная ячейка со встроенным биосенсором дляопределения лактата ......................................................................................................................... 1359.2.Создание неинвазивного монитора состояния гипоксии .................................................... 1399.3. Непрерывный мониторинг лактата в поте в состоянии покоя и в процессе физическойнагрузки................................................................................................................................................ 143ВЫВОДЫ ................................................................................................................................................................ 147СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................................................
1494СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙБЛберлинская лазурьЛОДлактатоксидазаГОДглюкозооксидазаЛДГлактатдегидрогеназасилоксанγ-аминопропилтриэтоксисиланПФСперфторсульфонированный полимер (аналог нафиона)НАДникотинамидадениндинуклеотидПАНОпорог анаэробного обменаКВВконденсат выдыхаемого воздухаПЭпланарный электродПЭТФполиэтилентерефталатПИАпроточно-инжекционный анализЦВАциклическая вольтамперометрия/вольтамперограммаСЭМсканирующая электронная микроскопияСЭХМсканирующая электрохимическая микроскопияСЛМсканирующая лазерная микроскопияфоновыйэлектролит0.1 М KCl, 0.1 M HClбуферныйраствор0.05 М KH2PO4, 0.1 M KCl, pH 6.0KМкажущаяся константа Михаэлиса5ВВЕДЕНИЕКонтроль за содержанием лактата в крови важен для клиническойдиагностики и спортивной медицины. В клинической диагностике уровень лактатав организме человека изменяется при наличии ряда заболеваний, например,гипоксиитканей,дыхательнойкардиогенногонедостаточности,илидиабета.бактериально-токсическогоВыработкалактатавшока,энергичноработающих скелетных мышцах может увеличиваться в десятикратном размере,что обосновывает интерес спортивной медицины к уровню лактата в крови.Разработка высокочувствительных, надѐжных и экспрессных методовопределения лактата представляет большой интерес.
Среди них биосенсорызанимаютоднуизлидирующихпозиций,таккакспецифичностьиммобилизованного фермента к своему субстрату позволяет проводить измерениянепосредственновобразце,несмотрянасложностьегосостава,безпредварительной пробоподготовки, что также сокращает время анализа. Внастоящее время для определения лактата широко используются биосенсоры,основанные на действии фермента лактатоксидазы, в таком случае осуществляетсядетектирование пероксида водорода, выделяющегося в ходе ферментативнойреакции. На сегодняшний день наиболее эффективными сенсорами на пероксидводорода являются электроды, модифицированные берлинской лазурью, котораяпозволяетизбирательноопределятьпероксидводородапореакцииеговосстановления в присутствии кислорода.Лактатоксидаза–оченьлабильныйфермент,поэтомуповышениестабильности является одной из ключевых задач при создании биосенсоров на еѐоснове.
Основные затраты рабочего времени приходятся именно на подбороптимальныхусловийиммобилизациифермента.Сканирующаяэлектрохимическая микроскопия является мощнейшим способом визуализации вближнейзонеповерхностнуюсканирующейипозволяетактивностьвотображатьлокальнуюмикроскопическомэлектрохимическойэлектрохимическуюразрешении.микроскопиидляАдаптацияскринингаферментсодержащих мембран позволяет существенно уменьшить трудоемкостьпоиска условий иммобилизации.6В клинической диагностике и спортивной медицине лактат определяют вкрови,однаковсѐбольшеевниманиеуделяетсянеинвазивнымметодамисследования, которые не нарушают целостности кожных и слизистых покровов, и,тем самым, исключают заражение и травматизм. Химический анализ образцов сцелью неинвазивной диагностики подразумевает наличие экскреторной жидкости,концентрации искомых метаболитов в которой коррелируют с содержанием их вкрови.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
