Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Эта идеология успешно былаприменена при создании мембран из перфторсульфонированного полимера,содержащихиммобилизованнуюглюкозооксидазуисозданияглюкозногобиосенсора [154]. А также лактатный биосенсор, превосходяий по аналитическимхарактеристикам существующие аналоги (табл. 1), работает с использованиемданного принципа иммобилизации фермента лактатоксидазы [50].4.3.Мембраны на основе силоксановМетод золь-гель иммобилизации все чаще используется для созданиябиосенсоров.
Оксид кремния – отличная матрица для стабилизации биомолекул.Золь-гель метод – низкотемпературный метод, в котором за счет гидролиза иполиконденсации алкоксидов металлов образуется материал с обширной сетьюпор. Размер пор в данном методе может контролироваться, чтобы быть достаточнобольшим для диффузии аналита к активному центру фермента, и достаточномаленьким, чтобы удерживать фермент.43Браун в 1990 году впервые продемонстрировал возможность иммобилизациибелковой молекулы в матрицу на основе геля кремния [155].
Пористаянеорганическаяматрицанаосновегеляперспективнадляразвитияэлектрохимических биосенсоров, так как она обладает достаточной жесткостью,химической инертностью, высокой стабильностью и ограниченным набуханием вводном растворе.Введение различных органических функциональных групп в матрицу наоснове неорганических алкоксидов приводит к органически модифицированнымгелям, имеющим ряд преимуществ по сравнению с неорганическими.
Во-первых, втакой матрице происходит специфичное связывание фермента, что повышаетэффективность иммобилизации. Во-вторых, это позволяет связать кофакторфермента с матрицей посредством химической реакции его с органическимигруппами геля. Кроме того, посредством введения различных гидрофильных илигидрофобных функциональных групп можно контролировать смачиваемостьматрицы [156, 157], толщину мембраны и величину пор [158, 159].В качестве прекурсоров для создания геля чаще всего используютсятетраметоксисилан (ТМОС) и тетраэтоксисилан (ТЕОС) (рис. 8).
В типичном зольгель процессе гидролиз этих мономеров приводит к силанолам, связывающимсядруг с другом с образованием полисилоксанов. Поликонденсация силанолов иполисилоксанов и последующее высушивание образующегося соединения навоздухе приводит к образованию пористой матрицы геля.
Схема процессавыглядит следующим образом [160]:RSi(OMe)3 + 3H2O → RSi(OH)3 + 3MeOHOHnRSi(OH)3 →O SiOHORКромеТМОСиТЕОСSiRчастоOHOSiRиспользуются+On H2Onмономерыстакимифункциональными группами, как амино-, этокси-, глицидокси- (рис. 8) [160].44OCH 2CH 3CH 3CH 2O Si1aOCH 2CH 3OCH 2CH 3CH 3CH 2O SiOCH 2CH 32b4dCH 2CHSiCH3OCH 2CH 33cOCH 3OCH 3CH 3O SiOCH 2CH 3CH 2CH 2CH 2NH 2OCH 3CH 3O SiCH 2CH 2CH 2OCH 2O5eOCH 36Рис. 8. Наиболее часто используемые прекурсоры в золь-гель методе: 1 –тетраэтоксисилан, 2 – дифенилдиэтоксисилан, 3 - метилвинилдиэтоксисилан, 4 – 3аминопропилтриметоксисилан, 5 – глицидоксипропилтриметоксисилан, 6 – γаминопропилтриэтоксисилан.3-аминопропилсилоксан γ-NH2-Pr-Si(OEt)3 (рис. 8, 6), известный как APTES,атакжефенилсилоксанивинилсилоксан,успешноприменяютсядляиммобилизации ЛОД на поверхности электродов при создании лактатныхбиосенсоров [50, 144, 145].Таким образом, золь-гель метод широко используется при созданиибиосенсоров и позволяет изменять характеристики электродов модификацией ихповерхности матрицей на основе силоксанов, содержащей различные проводящиеполимеры, медиаторы, ферменты.
Использование геля в качестве матрицы даетвозможность регулировать активность ферментов. Например, введение полимеровв матрицу геля влияет на активность иммобилизованной ГОД при созданиисенсора для амперометрического определения глюкозы [161].454.4.Мембраны на основе нафионаЗасчетизбирательнойпроницаемости,мембранынаосновеполиэлектролитов используются для разделения продуктов реакции или реагентовв ходе синтеза [162]. Мембраны на основе нафиона (Nafion™) - сополимераполитетрафторэтилена и полисульфонилфторидвинилового эфира(CF2CF2)x (CFOC F 2 )y(C3F6)OC2F 4S O 3 H+пользуются наибольшей популярностью при разработке электрохимическихсенсоров [104, 163].
На настоящий момент самой широко используемой формойнафиона является 5% раствор полиэлектролита в смеси низших спиртов с 10%содержанием воды, выпускаемый фирмой Aldrich (Германия).Исследования внутреннего строения твердого полимерного электролитапоказали, что он имеет двухфазную структуру (рис.
9). Основа полимера(гидрофобная фаза) состоит из фторуглеродных и эфирных цепей, расположенныхв пространстве таким образом, что функциональные сульфогруппы группируютсявнутри сферических полостей диаметром порядка 40 Å. Система связанных узкимиканалами полостей, содержащих гидратированные катионы, представляет собойвторую, гидрофильную фазу мембраны [164].Рис. 9. Внутренняя структура твердого полимерного электролита нафион.Мембрана нафион состоит из жесткого гидрофобного скелета, образованногополитетрафторэтиленовойцепью,областилокализацииионныхкластеров,содержащих воду, не отличающуюся по свойствам от объемной воды, ипромежуточной аморфной области [165].46В 80-х годах ХХ века в литературе были опубликованы первые данные овключении положительно-заряженных редокс-активных соединений в мембранынафион [166, 167].
Полученные в результате мембраны обладали высокой степеньюадгезии к поверхности платинового электрода и низким удельным электрическимсопротивлением.Отечественный аналог нафиона – перфторсульфонированный полимер(ПФС) применяется для создания мембран при конструировании биосенсоров, и,благодаря наличию отрицательно-заряженных сульфогрупп в составе нафиона иПФС, данные мембраны выступают эффективным барьером для анионов легкоокисляемых соединений, оказывающих мешающее влияние на отклик биосенсора.С помощью мембран нафиона и ПФС удалось добиться существенногоуменьшения влияния кофеина [168], урата [169], аскорбата [170], а в последствии ипарацетамола [170] на отклик глюкозных биосенсоров при физиологическихконцентрациях данных веществ.На основании приведенных литературных данных можно заключить, чтополимерные мембраны на основе водонерастворимых полиэлектролитов, вчастностинафионаиперфторсульфонированногополимера,являютсяперспективным материалом для иммобилизации ферментов на поверхностиэлектродов.
Такие мембраны характеризуются отсутствием набухаемости в воде,высокой степенью адгезии к поверхности электродов, низким удельнымэлектрическим сопротивлением, а также позволяют создавать биосовместимые (т.е.возможность использования в имплантируемых сенсорах) датчики на их основе.Таким образом, иммобилизация ферментов имеет немаловажное значениепри конструировании биосенсоров. Золь-гель метод широко распространен присоздании биосенсоров, использование геля в качестве матрицы дает возможностьизменять характеристики электродов.
Улучшенный способ иммобилизацииферментов, включающий солюбилизацию ферментов в водно-органических смесяхсвысокимсодержаниеморганическогорастворителя,позволяетсоздатьферментсодержащие мембраны повышенной стабильности и активности ирегулировать аналитические характеристики биосенсоров на их основе.47Глава 5. Сканирующая электрохимическая микроскопияОбщие сведения5.1.Локальные физические свойства поверхности, такие как топография,морфология и реакционная способность, являются одними из наиболее важныхзадач, решаемых учеными различных областей. Ответ на все эти вопросы даетсканирующая туннельная микроскопия, которая была открыта в 1981 годуГенрихом Рорером и Гердом Биннигом и положила начало развитию сканирующейзондовой микроскопии [171].
Сканирующая зондовая микроскопия позволяетполучить изображение поверхности и еѐ локальных характеристик. Это происходитпутем сканирования поверхности зондом, и получения трехмерного изображения(топографии) с высоким разрешением.В качестве подкласса сканирующей зондовой микроскопии в 1989 годуАлленом Бардом была предложена сканирующая электрохимическая микроскопия[172]. Она представляет собой мощнейший способ визуализации в ближней зоне. Вотличие от туннелирования или атомно-силовой микроскопии, СЭХМ позволяетотображатьместнуюхимическуюиэлектрохимическуюповерхностнуюактивность в микроскопическом разрешении.
При помощи данного методавозможно наблюдать пространственную реакционную активность и масстранспорт на границе жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело и жидкость-газ[173-176]. Сканирующая электрохимическая микроскопия применяется в такихобластяхкак:изображениеповерхностисенсора[177,178],измерениеконцентрации вещества в биологических клетках [179, 180], исследования оченьбыстрых электрохимических реакций [181, 182], изучение локальной коррозии[183, 184], сканирование электрокатализаторов [100], модификация поверхностей[185].Работа микроскопа основана на взаимодействии поверхности образца сзондом, который представляет собой микроэлектрод. Зонд фиксируется в системепозиционирования, что позволяет перемещать его в горизонтальном (X, Y) ивертикальном (Z) направлениях.
Фарадеевский ток, генерирующийся в системе впроцессе сканирования, измеряется с помощью (би)потенциостата.485.2.Принцип работы сканирующего электрохимического микроскопаПринципиальная схема сканирующего электрохимического микроскопаразделяется на три основные части. Во-первых, это (би)потенциостат, которыйконтролирует три (рабочий электрод - WE, электрод сравнения - RE ивспомогательный- CE) или четыре (два рабочих электрода - WE1 и WE2, электродсравнения - RE и вспомогательный - CE) электрода и одновременно измеряетфарадеевский ток, генерируемый подложкой и/или зондом (рис. 10). Во-вторых,это точная система позиционирования, которая позволяет перемещать зонд вгоризонтальном (X, Y) и вертикальном (Z) направлениях с высокой долей точности(до нм). И, наконец, это компьютер, который позволяет управлять системойпозиционирования, хранить данные, а затем их обрабатывать.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
