Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 9
Текст из файла (страница 9)
10. Схема измерений сканирующего электрохимического микроскопа.5.3.Гибкие планарные микроэлектроды в качестве зондов длясканирующей электрохимической микроскопииВ сканирующей электрохимической микроскопии сигнал, регистрируемыйзондом, зависит от реакционной способности поверхности образца и расстояния dмежду поверхностью и электродом. Для получения картины реакционной49способности образца величина d должна быть постоянной в течение всегоэксперимента. Наиболее часто используемыми зондами для СЭХМ являютсямикроэлектроды из платиновой проволоки, диаметром 10 или 25 мкм, запаянные встеклянныйкапилляр[186-191].Однакоприналичииуповерхностишероховатостей и неровностей возникают сложности при работе со стекляннымиэлектродами. Это происходит потому что расстояние между электродом иповерхностью не всегда остается неизменным, соответственно величина d непостоянна, а при столкновении с поверхностью образца микроэлектрод трескаетсяи ломается [192].ПредложенпредставляющихновыйизвидсебяамперометрическихгибкиепланарныезондовдляСЭХМ,микроэлектродыизполиэтилентерефталата (ПЭТФ) с углеродным микроканалом [192].
Гибкиемикроэлектроды лишены вышеописанного недостатка, поскольку тонкая пленкаПЭТФ изгибается при соприкосновении с поверхностью, что позволяет проводитьизмерения в непосредственном контакте с подложкой. Толщина пленки ПЭТФзадает постоянное рабочее расстояние между электродом и образцом, как показанона рис. 11.Рис. 11. Схема, демонстрирующая рабочее расстояние в отдалении и при контактес исследуемой подложкой при проведении экспериментов на микроскопе.Справа на рис.
11 показано как зонд касается поверхности и изгибается нанекоторый угол, что позволяет проводить сканирование СЭХМ в контактном50режиме с подложкой. Это является преимуществом, так как при сканированиишероховатыхповерхностейнаклонзондакомпенсируеттопографическиеособенности, образуя одинаковые рабочие расстояния. Выводы по положениюзонда в системе относительно подложки и введение зонда в контакт споверхностью осуществляют на основании кривой приближения (в англоязычнойлитературе ―approach curve‖). Кривая приближения представляет собой функциюзависимости тока, регистрируемого на микроэлектроде, от расстояния доисследуемой подложки. Для математического описания ситуации после касанияобразца зондом была введена вертикальная координата hР, которая представляетразницу hP = hA – lT между верхней точкой присоединения зонда hA и вертикальнойкоординатой длины выпрямленного зонда lT (рис.
11). Таким образом, действующеерабочее расстояние d определяется как:,где tL – толщина пленки ПЭТФ, покрывающей углеродный канал, α – уголмежду плоскостью сечения зонда и поверхностью образца. Расположение зонда вконтактном и неконтактном режимах показано на рис. 11.Кривая приближения моделируется только при hp ≥ 0 потому чтоэластическая деформация и скольжение зонда при контакте с подложкой не могутбыть объяснены текущей моделью [192].Сканирование и получение изображения СЭХМ в контактном режиме былопредставлено и ранее [192, 193]. Однако основным преимуществом использованиягибких планарных зондов для СЭХМ является возможность проведениясканирования с постоянной величиной d по неровной и наклонной поверхности безкаких-либо дополнительных приспособлений [193].Таким образом, сканирующая электрохимическая микроскопия являетсяодним из мощнейших современных методов исследования локальных свойствповерхности, который позволяет регистрировать местную электрохимическуюактивность в ближней зоне.
Путем адаптации сканирующей электрохимическоймикроскопииферментсодержащиемембраныразличныхсоставовможно51сканироватьдлявыявленияпрофиляконцентрациипероксидаводорода,выделяющегося в ходе ферментативной реакции, с целью упрощения и ускоренияпроцесса оптимизации биосенсоров.***Из анализа литературных данных можно сделать следующие выводы.
Лактатявляется одним из важнейших метаболитов, рассматриваемых в клиническойдиагностике и в спортивной медицине. Данные по концентрации лактата в крови впроцессефизическихупражненийпозволяютклассифицироватьрежимыинтенсивности беговых или иных нагрузок у спортсменов и, как следствие,повыситьвозможностиреализациифункциональныхитренировочныхпотенциалов. У профессиональных спортсменов измерение уровня лактата в кровипредставляет неотъемлемый элемент тренировки, в связи с чем, неинвазивныеметоды определения аналита вызывают большой интерес. Исследования показали,что увеличение концентрации лактата в крови коррелирует с увеличениемсодержания аналита в поте [11, 77, 83].Содержание лактата в поте в состоянии покоя по нескольким источникамсоставляет от 4 до 25 мМ [11, 84-87], однако при тяжелых физических нагрузкахэта концентрация достигает 40 – 80 мМ [11, 84, 86].
Из всего множества методовопределения лактата не существует известных, позволяющих проводить измерениеаналита в данном диапазоне определяемых концентраций, даже так называемый«неинвазивный датчик для определения лактата в человеческом поте в процессереального времени» лимитируется только 20 мМ как самой высокой определяемойконцентрацией [92], чего не достаточно для мониторинга лактата в процессефизических нагрузок. В настоящей работе предлагается решить данную проблемупутем создания высокоэффективных биосенсоров для определения лактата,демонстрирующих наилучшие аналитические характеристики, с возможностьюрасширения диапазона определяемых концентраций в область высоких значений сцелью создания неинвазивного монитора на лактат для анализа неразбавленногопота.Лидирующееместосредиметодовопределениялактатазанимаютферментативные методы, основанные на каталитическом действии фермента52лактатоксидазы,обладающиенаивысшейспецифичностью,точностьюивоспроизводимостью результатов. При этом среди электрохимических биосенсоровдляанализареальныхобъектовнаибольшеераспространениеполучилибиосенсоры первого поколения, при создании которых решающими факторамиявляются выбор трансдьюсера пероксида водорода и иммобилизация фермента наповерхности электрода.Как известно, наилучшим известным электрокатализатором восстановленияпероксида водорода признана берлинская лазурь, позволяющая проводитьэксперименты при потенциале 0.00 В, и, благодаря чему, исключить мешающеевлияние восстановителей, присутствующих в биологических жидкостях.
Аиспользование улучшенного способа иммобилизации ферментов, включающегосолюбилизацию ферментов в водно-органических смесях с высоким содержаниеморганического растворителя, позволяет создать ферментсодержащие мембраныповышеннойстабильностииактивностиирегулироватьаналитическиехарактеристики биосенсоров на их основе.Сканирующая электрохимическая микроскопия является современнымметодом исследования локальных свойств поверхности и признана мощнейшимспособом визуализации в ближней зоне. В данной работе предложено адаптироватьсканирующуюэлектрохимическуюмикроскопиюдляскринингаферментсодержащих мембран с целью упрощения и ускорения процессаоптимизации биосенсоров.53Глава 6.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ6.1.МатериалыВсе эксперименты проводились в дистиллированной воде. В работе былииспользованы следующие неорганические соли: хлорид калия KCl (х.ч., Химмед,Россия), дигидрофосфат калия KH2PO4 (ч.д.а., Хеликон, Россия), хлорид железашестиводный FeCl3∙6H2O (х.ч.), гексацианоферрат (III) калия K3[Fe(CN)6] (х.ч.).Раствор соляной кислоты готовили из фиксаналов фирмы Germen(Германия).
Для нейтрализации буферов использовали гидроксид калия KOHфирмы Реахим (Россия).Для изготовления мембран использовали: γ-аминопропилтриэтоксисилан γ-NH2PrSi(OEt)3 с концентрацией 97%в изопропиловом спирте, предоставленный сотрудниками группымезоморфныхкремнеорганическихсоединенийинститутаэлементорганических соединений им. А. Н.
Несмеянова РАН (ИНЭОСРАН); отечественный аналог нафиона – перфторсульфонированный полимер(ПФС)МФ4СК(10%-ныйраствор визопропиловом спирте),производство ОАО «Пластполимер», Санкт-Петербург, Россия.Для нейтрализации растворов ПФС использовали 25% раствор гидроксидааммония NH4OH (Феррейн, Россия).Для создания биосенсоров была использована лактатоксидаза (ЕС 1.1.3.2) изPediococcus species в виде лиофилизованного белка с заявленной активностью 72U∙мг-1 (Sorachim, Швейцария).Для исследования аналитических характеристик сенсоров для определенияпероксид водорода и биосенсоров применяли 30% раствор пероксида водородаH2O2 (Реахим, Россия) и L-лактат 40% раствор (ICN, США) соответственно.Точную концентрацию пероксида водорода определяли спекрофотометрически придлине волны 230 нм ((H2O2) = 72.7 М-1·см-1). Точную концентрацию лактатаопределяли с помощью кислородного электрода Кларка.54Для активации потовой железы использовали пилокарпин 1% (ФГУП«Московский эндокринный завод», Москва, Россия).Образцыпотабылипредоставленыстудентами,аспирантамиисотрудниками МГУ им.
М. В. Ломоносова и другими добровольцами.В работе были использованы растворы:для анализа в проточно-инжекционной системе, в режиме периодическоготестирования (batch-режим), в проточной тонкослойной ячейке с капилляром и внеинвазивном мониторе: буферный раствор – 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0);для активации берлинской лазури и проведения электрофореза: фоновый электролит – 0.1 M KCl, 0.1 M HCl.Длясозданиякапилляранаповерхностипланарногобиосенсораиспользовали двухстороннюю клейкую ленту (фирмы ООО «Бизнес Парк»,Россия).6.2.ОборудованиеПробоподготовкаВ ходе работы использовали шприцы Hamilton производства Aldrich (США)на 5, 10 и 20 мкл.Мешалка для проб Vortex V6 (ELMI Латвия).Планарные электродыВ работе использовали планарные электроды (рис.
12, 13), изготовленныеметодом трафаретной печати (ООО «Русенс», Россия) на трафаретном печатномстанке SCF – 300 (Technical Industrial Co. Ltd., Гонконг) с использованиемматериалов: пленка полиэтилентерефталата толщиной 250 мкм (Владимирскийхимический завод, Россия); углероднаярезистивнаяполимернаяпастаПУРП-ГП-Н(НПП«Дельта-Пасты», Россия); высокотемпературная углеродная резистивная полимерная пастаПУРП-005 (НПП «Дельта-Пасты», Россия);55 серебросодержащая полимерная паста ПСП-2 (НПП «Дельта-Пасты»,Россия); углеродная паста C10903P14 (Gwent Electronic Materials Ltd.,Великобритания); у/ф отверждаемая изоляционная паста (Gwent Electronic Materials Ltd.,Великобритания).Производство планарных электродов состояло из трѐх стадий:1) на основу из поливинилхлорида наносили слой серебра толщиной 20мкм,2) на область рабочего и вспомогательного электродов наносили слойуглеродной пасты,3) сверху наносили слой изолятора, оставляя открытыми рабочий,вспомогательный электроды и электрод сравнения.Все значения потенциалов, приводимых в работе, измерены относительнохлоридсеребряного электрода.Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
