Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 13
Текст из файла (страница 13)
На протяжении некоторого промежутка времени ферментконтактировал с органическим растворителем, что приводило к потере активностиЛОД. Ранее проводили исследование влияния органических сред с низкимсодержанием воды на активность фермента, изучая остаточную активность ЛОДпосле инкубации в водно-органической смеси. Зависимость остаточной активностилактатоксидазы от содержания воды в водно-органической смеси представляетсобой сигмовидную кривую с высоким плато активности в районе 5 - 10% ипостепенным снижением активности от 10 до 20%, локальный экстремумнаблюдается в области 15%-ного содержания воды, что совпадает с точкойобразования азеотропа изопропанол-вода [89].В настоящей работе было выбрано содержание воды в мембране 10% иизопропанола – 90%, так как при этом соотношении водно-органической фазысохраняется довольно высокая активность фермента и можно включить в мембранудостаточное количество ЛОД, избегая больших погрешностей при отборе пипеткойнужного объѐма водного раствора фермента.Ранее в лаборатории электрохимических методов химического факультетаМГУпроводилииммобилизациюЛОДвмембраныγ-аминопропилтриэтоксисилана, фенилсилоксана и винилсилоксана, содержанием всмеси от 0.1 до 0.5 об.% [89].
Из рассмотренных мембранообразующих соединенийсодержание 0.3% γ-аминопропилтриэтоксисилана было выявлено в качествелучшего,т.к.биосенсорнаосноведаннойсмесиобладалнаивысшейчувствительностью (0.18 А·М-1·см-2), а также широким линейным диапазономопределяемых концентраций (1·10-6 - 1·10-3 М лактата) и низким пределомобнаружения.Поскольку ЛОД представляет собой очень лабильный фермент, то былонеобходимо оптимизировать условия иммобилизации с целью увеличениястабильности биосенсоров на еѐ основе.
В настоящей работе было решеноисследоватьболеевысокиесодержанияγ-аминопропилтриэтоксисиланавиммобилизующей смеси для фермента, что могло привести к повышениюстабильности и активности биосенсоров на основе данных мембран.79Сэтойцельюбылопредложеноиспользоватьсканирующуюэлектрохимическую микроскопию, а именно, сканирование матрицы различныхферментсодержащих мембран на единой подложке и выявление максимумовлокальнойферментативнойактивности.Засчеттого,чтосканированиеосуществляется на единой подложке в совершенно идентичных условиях, тонагляднонаблюдаетсяПредполагалось,чтокартинамаксимумовбиосенсорнаосновеферментативноймембраны,активности.демонстрирующейнаивысшую ферментативную активность в СЭХМ, впоследствии будет обладатьнаилучшими аналитическими характеристиками.Стоит отметить, что на подготовку одного биосенсора для определениялактата уходит в среднем 3 часа (1 час на осаждение БЛ на планарный электрод, 1час на нанесение ферментсодержащей мембраны и 1 час на проведениеградуировки), а для подготовки эксперимента с использованием СЭХМ в среднем1.5 часа (0.5 часа на осаждение БЛ на микроэлектрод, 1 час на нанесениеферментсодержащихэкспериментовсмембранСЭХМнанаподложку).подложкеможноОднакоприисследоватьпроведенииот1до9ферментсодержащих мембран одновременно.
Таким образом, время подготовкиединичного эксперимента уменьшается примерно в 20 раз.Использование сканирующей электрохимической микроскопии7.3.для скрининга ферментсодержащих мембран различного составаСканирующаяэлектрохимическаямикроскопия,являясьподклассомсканирующей зондовой микроскопии, представляет собой современный методотображенияместнойэлектрохимическойактивностивмикроскопическомразрешении.В настоящей работе СЭХМ была впервые адаптирована для определенияпрофиляконцентрациипероксидаводорода,выделяющегосявходеферментативной реакции. С помощью микроскопа сканировали участок подложкис ферментсодержащими мембранами и измеряли ток, продуцируемый намикроэлектроде.
На основании регистрируемого тока получали изображение, покоторомусудилиобизмененииферментативнойактивностиЛОДпри80иммобилизации в различные полимерные мембраны, таким образом, целью быловыявить наилучший состав смеси для иммобилизации фермента для повышениястабильности и чувствительности биосенсоров для определения лактата на основепланарных электродов, модифицированных БЛ.Для этого гибкие планарные микроэлектроды, изготовленные методомлазерной абляции, модифицировали БЛ и использовали в качестве зондов дляСЭХМ. На подложке иммобилизовали ЛОД в различные мембраны и, с помощьюзонда, регистрировали локальный ток восстановления пероксида водорода врастворе лактата в буферном растворе, как схематически показано на рис. 26.
Дляиммобилизации ЛОД использовали силоксан, с содержанием в смеси от 0.1 до 3.0об.%.Рис. 26. Схема измерений, проводимых на сканирующем электрохимическоммикроскопе.7.3.1.Изготовление гибких планарных микроэлектродов имодификация их берлинской лазурьюГибкиеизготавливалипланарныесмикроэлектродыиспользованиемметодав качестве зондовдлялазернойИзображениеабляции.СЭХМпоперечного сечения микроэлектрода, сделанное с помощью сканирующеголазерного микроскопа (СЛМ) показано на рис. 27.
Из данного изображения была81рассчитана площадь рабочей области электрода, составляющая в данном случае322 мкм2.Рис. 27. Изображение поперечного сечения гибкого планарного микроэлектрода,сделанное при помощи сканирующего лазерного микроскопа.На рабочей поверхности гибких планарных микроэлектродов осаждалиэлектрохимически кристаллы берлинской лазури. Ростовой раствор содержал 4 мМK3[Fe(CN)6] и 4 мМ FeCl3 в фоновом электролите 0.1 М КСl, 0.1 M HCl, даннаяметодика была разработана ранее и успешно используется для модификации БЛпланарных электродов и микроэлектродов [195-197].Микроэлектроды,модифицированныеБЛ,подвергалипотенциодинамической обработке в диапазоне потенциалов от -0.05 до 0.35 В вфоновом электролите 0.1 М КСl, 0.1 M HCl. Покрытие берлинской лазурисчиталось насыщенным катионами калия, если последние ЦВА обработки имелиодинаковые площади, т.е.
совпадали или незначительно отличались при наложениидруг на друга.Циклическаяпредставленанаэлектроосаждениявольтамперограммарис.БЛ.28,наСтрелкамиактивациивставкепоказаноБЛнаприведенаувеличениемикроэлектродевольтамперограммазначенийсоответствующее увеличению количества БЛ, осаждаемой от цикла к циклу.токов,824001-20I, нАI, нА200-1-40-2-0.10.00.10.2E, В0.40.60.30.80.4E, ВРис.
28. Циклическая вольтамперограмма активации берлинской лазури намикроэлектроде в растворе 0.1 M KCl и 0.1 M HCl, скорость развертки 40 мВ/с. Навставке: электроосаждение БЛ, 5 - 7 циклов в растворе 4 мM FeCl3, 4 мMK3[Fe(CN)6] в фоновом электролите, скорость развертки 20 мВ/с.7.3.2.определенияАналитические характеристики микросенсоров дляпероксидаводородавкачестве зондовдлясканирующейэлектрохимической микроскопииДля определения качества полученных зондов для СЭХМ исследовалианалитические характеристики микроэлектродов, модифицированных БЛ. С этойцелью определяли пероксид водорода в диапазоне концентраций 1∙10-5 - 1∙10-2 М вbatch-режиме в буферном растворе при постоянном перемешивании. Модельныерастворы Н2О2 тестировали с помощью микросенсора трехкратно, на основаниичего строили градуировочный график (рис. 29).
Коэффициент чувствительностиопределяликактангенсугланаклонаначальнойчастиградуировочнойзависимости токового отклика сенсора на рассчитанную концентрацию пероксидаводорода в растворе. Площадь рабочего электрода составляла 322 мкм2.83-21.2j, мАсмj, мАсм-210.80.10.4C(H2O2), M0.05.0x10-41.0x10-30.01-5-410-31010-210C(H2O2), MРис. 29. Градуировочный график для определения пероксида водорода с помощьюмикросенсора, модифицированного берлинской лазурью. Буферный раствор 0.1 MKCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В (n = 3, P = 0.95).Коэффициент чувствительности созданных сенсоров на пероксид водородасоставляет 1.6 ± 0.5 А·М-1·см-2 (n = 4, P = 0.95), а линейный диапазонопределяемых концентраций H2O2 три порядка от 1∙10-5 до 1∙10-2 М, пределобнаружения 9∙10-6 М.Для оценки операционной стабильности сенсора фиксировали времяабсолютной неизменности токового отклика.
Первые 2 часа работы сенсорстабильно работает и не теряет сигнала (рис. 30), а также спустя 8 часовнепрерывной работы обеспечивается по крайней мере 70% от начального значения,а после 17 часов работы - около 57% от первоначального сигнала тока. Стоитотметить, что стабильность была измерена при высокой концентрации пероксидаводорода (1 мМ H2O2), что представляет собой довольно жесткие условия длясенсора, так как продукт восстановления H2O2 – гидроксил-ионы – растворяютберлинскую лазурь [200], и чем концентрированнее раствор пероксида водорода,тем быстрее смывается покрытие пленок БЛ. Концентрация пероксида водорода вреальномэкспериментенаСЭХМнанесколькоследовательно, стабильность будет гораздо выше.порядковменьше,а,843.0j, мAсм-22.52.01.51.00.5024141618время, чРис. 30.
Операционная стабильность микросенсора на пероксид водорода в batchрежиме при постоянном перемешивании в растворе 1 мМ H2O2. Буферный раствор0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.Таким образом, впервые был разработан сенсор на пероксид водорода дляиспользования его в качестве зонда для сканирующей электрохимическоймикроскопии.
Микроэлектрод, модифицированный БЛ, характеризуется высокойчувствительностью, широким линейным диапазоном определяемых концентраций,вплоть до трех порядков, а также высокой операционной стабильностью, которойдостаточно для проведения измерений СЭХМ (длительность измерений составляетдо 10 часов). Можно сделать вывод, что разработанные сенсоры подходят длядлительной непрерывной работы в качестве зондов для СЭХМ для определенияпрофиляконцентрациипероксидаводорода,выделяющегосявходеферментативной реакции.7.3.3.Получениеизображенияферментсодержащеймембраны с использованием сканирующего электрохимического микроскопаИммобилизация лактатоксидазы в мембрану γ-аминопропилтриэтоксисиланапроисходила из сред с высоким содержанием органического растворителя [89,198].Коммерческийпрепаратсилоксанразбавлялиабсолютированнымизопропиловым спиртом до необходимой концентрации, фермент ЛОД разбавляли85дистиллированной водой до концентрации 10 мг/мл.
Далее к спиртовому растворусилоксана добавляли водный раствор фермента, активно перемешивали, после чегонаносили 2 мкл смеси на подложку. Стоит иметь ввиду, что спустя несколькоминут после попадания в водный раствор силоксан полимеризуется, густеет и впробирке Эппендорфа образуется взвесь с белым осадком, которую уженевозможно нанести на подложку, поэтому нанесение смеси следует проводитьнемедленно после смешения водного и спиртового растворов.В качестве подложки для иммобилизации фермента при первоначальномрассмотрениибылаиспользованапленкаполиэтилентерефталата(ПЭТФ),используемая при печати планарных электродов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
