Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Однако при проведенииэкспериментов СЭХМ сигнала не наблюдалось, для объяснения данного явлениямембрана была изучена с помощью сканирующего лазерного микроскопа (СЛМ).При рассмотрении участка подложки с ферментсодержащей пробой послепроведенного эксперимента было обнаружено, что от мембраны остались толькообломки по краям капли.
Было видно, что ферментсодержащая мембрана быласломана (рис. 31). Это могло происходить при фиксировании образца, либо присканировании подложки микроэлектродом.ПЭТФФерментсодержащаямембранаРис. 31. Изображение сломанной ферментсодержащей силоксановой мембраны наподложке из полиэтилентерефталата.Таким образом, было выявлено, что мембрана на поверхности ПЭТФрастрескивается и ломается, для решения этой проблемы в качестве подложки былаиспользована пленка ПЭТФ с нанесенной на неѐ графитовой пастой. Данное86покрытие полностью воспроизводит поверхность планарных электродов и, темсамым, приближает условия эксперимента к реальным – при иммобилизациифермента на поверхность планарных структур для создания биосенсоров на лактат.С помощью сканирующей электрохимической микроскопии регистрировалиэлектрохимическую активность в микроскопическом разрешении, для этогоэксперимент проводили в контактном режиме с подложкой.
Приведениемикроэлектрода в контакт с исследуемой поверхностью осуществлялось наосновании кривой приближения зонда в растворе 5 мМ лактата в буферномрастворе (рН 6.0). Данная концентрация была выбрана для достижениямаксимального контраста изображения.В режиме обратной связи зонд изначально находился на некоторомрасстоянии от исследуемой поверхности, где через него протекал фоновый ток,обусловленный фоновым электролитом и лимитированный полусферическойдиффузией электроактивных частиц к рабочей поверхности микроэлектрода. Зонтпозиционировался таким образом, чтобы при касании подложки он находился украя ферментсодержащей капли, а сканирование по оси Х проходило по еѐ центру.По мере приближения к поверхности диффузия всѐ больше затруднялась, из-зачего наблюдалось постепенное увеличение катодного тока в соответствии с рис.
32.-0.30I, нА-0.35-0.40-0.45050100150200250300z, мкмРис. 32. Кривая приближения зонда в растворе 5 мМ лактата в буферном растворе(по оси абсцисс отложено расстояние, пройденное зондом, по оси ординат – ток);скорость 1 мкм/с, шаг 0.5 мкм, потенциал 0.00 В.87Ось Z, приведенная на рис.
32, является относительной величиной,демонстрирующей степень приближения к подложке, наглядно представлена нарис. 33. Как видно на рис. 32, от 50 до 200 мкм по оси Z наблюдается увеличениекатодного тока, что демонстрирует процесс восстановления пероксида водорода намикроэлектроде, далее - точка перегиба, соответствующая расстоянию, на которомзонд коснулся поверхности. После этого гибкий планарный микроэлектродначинает изгибаться, что обусловливает скачок и последующий выход настационарный уровень.Рис. 33. Физический контакт зонда с исследуемой поверхностью.Послеприведениязондавконтактсподложкой,содержащейиммобилизованную ЛОД, микроэлектрод опускали ниже на величину hp = -100мкм, достигая изгиба зонда на некоторый угол для более уверенного контакта сисследуемой поверхностью.
Далее проводили линейное сканирование пробы пооси Х.На рис. 34 видно, что по мере приближения к центру капли наблюдаетсявозрастание катодного тока, что демонстрирует процесс восстановления наэлектродепероксидаводорода.Дляподтвержденияполученныхданныхэксперимент был воспроизведен в отсутствие фермента в мембране, в данномслучае, как и ожидалось, не наблюдалось возрастания катодного тока припрохождении зондом вдоль капли.88без ЛОД-0.4I, нАс ЛОД-0.8-1.2-4000-20000x, мкмРис.
34. Линейное сканирование ферментсодержащей силоксановой мембраны ианалогичной капли в отсутствие фермента в растворе 5 мМ лактата в буферномрастворе; скорость 50 мкм/с, шаг 50 мкм, hp = -100 мкм, потенциал 0.00 В.Криваяприближенияилинейноесканированиепробыявляютсянеотъемлемыми составляющими проведения экспериментов СЭХМ, именно спомощью них демонстрируется пригодность сенсора и подложки для полученияизображенияиммобилизованнойЛОДпутемамперометрическойдетекциивыделяющегося при ферментативном катализе пероксида водорода.Подложкананесенной ферментсодержащеймембранойнаходилась врастворе 5 мМ лактата в буферном растворе для последующего сканированияэлектрохимической активности поверхности в режиме коллекции-генерации.Данная концентрация лактата была выбрана для усиления контраста наполучаемом изображении между областями, где пероксид водорода генерировалсяферментом, и областью, где Н2О2 появлялся в результате диффузии.
Режимколлекции-генерации заключается в том, что на модифицированном БЛ зондеподдерживается рабочий потенциал, необходимый, в данном случае, длявосстановления получающегося продукта ферментативной реакции пероксидаводорода, и регистрируется величина силы тока в каждой точке над поверхностью.89Для сканирования была выбрана область поверхности 4х4 мм (рис. 35).Установленный рабочий потенциал составлял 0.00 В, скорость линейногосканирования 25 мкм/с, шаг по оси Х 25 мкм, расстояние между областямилинейного сканирования установлено 50 мкм, что соответствует приблизительнойI, нАширине электрода.Рис.
35. Изображение участка подложки с ферментсодержащей силоксановоймембраной в растворе 5 мМ лактата в буферном растворе. Скорость 25 мкм/с, шагпо Х 25 мкм, шаг по Y 50 мкм, hp = -100 мкм, потенциал 0.00 В.Синие участки на рис. 35 соответствуют высоким значениям катодных токов,демонстрируя, таким образом, участки подложки, где происходит генерацияпероксида водорода в результате ферментативной реакции. Видно, что наивысшийсигнал наблюдается в центре капли.
Необходимо заметить, что, несмотря напроведение эксперимента по получению изображения в течение 10 часов,наблюдается заметный локальный контраст с точностью до десятков микрон междуобластями генерации и областями проникновения пероксида в результатедиффузии, что говорит о высокой точности данного метода получения трехмерногоэлектрохимического изображения.90Получение7.3.4.ферментсодержащихтрехмерногомембрансизображенияиспользованиемсканирующегоэлектрохимического микроскопаВкачествемембранообразующеговысокочувствительноголактатногосоединениябиосенсорабылдлясозданиярассмотренγ-аминопропилсилоксан с содержанием в смеси для иммобилизиции фермента от 0.1до 3.0 об.%.
С помощью СЭХМ одновременно сканировали несколькоферментсодержащих силоксановых мембран на единой подложке. Содержаниесилоксана в иммобилизующей смеси составляло: 0.1, 0.3, 0.6, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 и3.0 об.%. Одно сканирование данной подложки с нанесенными мембранамипозволялосудитьобизмененииферментативнойактивностиЛОДприиспользовании различных содержаний силоксана для иммобилизации. В качествепримера приведены четыре мембраны с содержанием силоксана: 0.3%, 0.9%, 1.5%,2.8% в иммобилизующей смеси. Объем пробы каждого состава - 0.1 мкл,измеренияпроводилисьврастворе50мМлактата,приготовленномсиспользованием буферного раствора. Данная концентрация лактата была выбранадля получения максимального контраста изображения.Приведение зонда в контакт с поверхностью осуществлялось на основаниикривой приближения в растворе 50 мМ лактата, приготовленном с использованиембуферного раствора.
По мере приближения к поверхности диффузия всѐ большезатрудняется, из-за чего наблюдается постепенное увеличение величины катодноготока в соответствии с рис. 36. В районе 700 мкм на кривой наблюдается точкаперегиба, соответствующая расстоянию, на котором зонд коснулся поверхности,далее зонд начинает изгибаться, что обусловливает последующее уменьшение тока.Послеприведениязондавконтактсподложкой,содержащейферментсодержащие мембраны, микроэлектрод опускали ниже на величину hP = 100 мкм, достигая изгиба зонда на некоторый угол для более уверенного контакта сисследуемой подложкой.Далее проводили линейное сканирование пробы по оси Х.
Видно, что помере прохождения вдоль капель ( в областях -8000, -7000, -4000 и -1500 мкм по осиХ) наблюдается увеличение катодных токов, что демонстрирует протеканиебиохимической реакции (рис. 37).91-0.1I, нА-0.2-0.3-0.4-0.50200400600800z, мкмРис. 36. Кривая приближения зонда в растворе 50 мМ лактата, приготовленном сиспользованием буферного раствора (по оси абсцисс отложено расстояние,пройденное зондом, по оси ординат – ток); скорость 1 мкм/с, шаг 0.5 мкм,потенциал 0.00 В.-0.4I, нА-0.8-1.2-1.6-9000-6000-30000x, мкмРис.
37. Линейное сканирование четырех ферментсодержащих силоксановыхмембран в растворе 50 мМ лактата в буферном растворе; скорость 50 мкм/с, шаг 50мкм, hP = -100 мкм, потенциал 0.00 В. Содержание силоксана в смеси дляиммобилизации фермента (слева направо): 0.3%, 0.9%, 1.5%, 2.8%.92Для получения изображения СЭХМ была выбрана область размером 10.5х1.5мм (рис. 38). Установленный рабочий потенциал для амперометрической детекции0.00 В, скорость линейного сканирования 50 мкм/с, шаг по оси Х 50 мкм,расстояние между областями линейного сканирования 50 мкм, что соответствуетприблизительной ширине электрода.I, нАРис. 38. Объѐмное изображение участка поверхности с ферментсодержащимисилоксановыми мембранами в растворе 50 мМ лактата в буферном растворе;скорость 50 мкм/с, шаг по Х 50 мкм, шаг по Y 50 мкм, hp = -100 мкм, потенциал0.00 В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
