Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 10
Текст из файла (страница 10)
12. Планарные электроды, изготовленные методом трафаретной печати.56Рис. 13. Изображение планарного электрода.Гибкие планарные микроэлектроды3В работе использовались гибкие планарные микроэлектроды в качествезондов для сканирующего электрохимического микроскопа (рис. 14). Дляизготовления микроэлектродов использовали следующие материалы: пленка ПЭТФ толщиной 100 мкм (Melinex, США); углеродная резистивная полимерная паста Electradorcarbonink (ElectraPolymer & Chemicals Ltd., Великобритания); пленка ПЭ(полиэтилен)/ПЭТФ для ламинирования (PE/PET, Payne,Великобритания).Лазернуюабляциюпроводилисиспользованиемэксимерногоультрафиолетового Ar F-лазера (Lambda Physik, Германия).контактная областьмикроэлектродапленка ПЭТФуглеродный микростерженьРис.
14. Схема микроэлектрода, изготовленного методом лазерной абляции.3Микроэлекроды изготавливались соискателем в процессе стажировки в лаборатории физической ианалитической электрохимии Федеральной политехнической школы Лозанны (Швейцария).57Спектрофотометрические измеренияИзмерение поглощения растворов пероксида водорода осуществляли спомощьюспектрофотометраLKB-UltraspecVII(Bromma,Швеция).Вэксперименте использовали кварцевую кювету толщиной 1 см.Электрохимические измеренияЭлектрохимические измерения с использованием планарных электродовпроводилиспомощьюуниверсальногопортативногопотенциостата-гальваностата PalmSens или EmStat (Palm Instruments BV, Нидерланды) иперсонального компьютера.Модификация гибких планарных микроэлектродов БЛ проводилась сиспользованием универсального портативного потенциостата - гальваностатаPalmSens. В качестве вспомогательного электрода использовалась платиноваяпроволока,вкачествеэлектродасравненияиспользовалиистинныйхлоридсеребряный электрод, находящийся в 1 М KCl и отделенный от ростовогораствора керамической мембраной.СЭХМ-измерения4 проводили с использованием (би)потенциостата IviumCompact Stat под управлением пакета программ Ivium Soft (Ivium Technologies,Нидерданды).
В ходе эксперимента использовалась трехэлектродная система, вкачестве рабочего электрода использовали гибкие планарные микроэлектроды,модифицированные БЛ. В качестве вспомогательного электрода - платиноваяпроволока, в качестве электрода сравнения - серебряная проволока. Измеренияпроводились в растворе лактата, приготовленном с использованием буферногораствора (рН 6.0).В ходе экспериментов поддерживали постоянное напряжение 0.00 В.Для контроля кислотности среды использовали рН метр Cole-Parmer LH-407.Проточно-инжекционный анализСистема ПИА состояла из перистальтического насоса Маsterflex US (ColeParmer Instrument Company, США) и инжектора с объемом петли 50 мкл,соединенных с проточной амперометрической ячейкой. В первом случае ячейка4Эксперименты с использованием СЭХМ проводились автором в процессе стажировки в лабораториифизической и аналитической электрохимии федеральной политехнической школы Лозанны (Швейцария).58представляла собой рабочую камеру, куда помещается планарный электрод (рис.15, а), во втором случае ячейка представляла собой капилляр, одной из стеноккоторого является планарный электрод (рис.
15, б).Электрохимический сенсор представлял собой трѐхэлектродную систему: наего поверхности находятся рабочий и вспомогательный электроды, а такжеэлектрод сравнения.Рис.15.Схемапроточно-инжекционнойсистемы:1–проточнаяамперометрическая ячейка, 2 – инжектор, 3 – перистальтический насос; а –стандартная проточная ячейка, б - тонкослойная ячейка.Для тестирования амперометрического сенсора система подсоединялась кпотенциостату и персональному компьютеру.Измерения в режиме периодического тестирования (batch)Измерениявпериодическомрежиметестированияпроводилиприпостоянном перемешивании на магнитной мешалке в ячейке ѐмкостью 250 мкл(рис.
16), либо в стакане ѐмкостью 3 или 5 мл. Данные измерения встречаются влитературе под названием batch-режим (в «пакете») или стационарный режим.Для тестирования сенсоров и биосенсоров система подсоединялась кпотенциостату и персональному компьютеру.59Рис. 16. Ячейка для определения в batch-режиме.Сканирующая электрохимическая микроскопияИзмерения на сканирующем электрохимическом микроскопе проводили сиспользованиемспециальнойэлектрохимическойустановки,использующейсистему позиционирования Märzhäuser (Märzhäuser Wetzlar Gmb H&Co KG,Германия) с пьезоэлектрической системой (PI, Gmb H&Co KG, Германия) подуправлениемнекоммерческогопрограммногообеспеченияSECMx,всеэлектрохимические измерения проводили с использованием (би)потенциостатаIvium Compact Stat (Ivium Technologies, Нидерданды) (рис.
17).Рис. 17. Принципиальная схема сканирующего электрохимического микроскопа.Зонды для сканирующего электрохимического микроскопа представлялисобой гибкие планарные микроэлектроды, модифицированные БЛ. Типичнаяплощадь рабочего электрода составляла порядка 200 - 300 мкм2.60Ячейка, подключенная к бипотенциостату, содержала рабочий электрод –микроэлектрод, модифицированный БЛ, платиновый вспомогательный электрод ихлоридсеребрянный электрод сравнения. Все эксперименты проводили в растворелактата, проготовленном с использованием буферного раствора (рН 6.0).Сканирующая электронная микроскопия5Дляполучениятрехмерногоизображенияшероховатости,текстурыповерхности и формы ферментсодержащих мембран использовали сканирующийэлектронный микроскоп LEO 1550 (Carl Zeiss, Йена, Германия).Сканирующая лазерная микроскопия6Бесконтактные 2D и 3D изображения шероховатости и текстуры поверхностиферментсодержащих мембран получали с помощью сканирующего лазерногомикроскопа VK 8700 (Keyence, Осака, Япония).Измерения на профилометреДля измерения высот ферментсодержащих мембран и последующего расчетаплотностей проводились измерения на профилометре (Talystep, Taylor-Hobson,Великобритания).ЭлектрофорезДля усиления потоотделения проводили электрофорез с 1% пилокарпином.Для электрофореза использовали Гальванизатор «Поток-1» (ЗАО «Завод ЭМА»,Екатеринбург, Россия).6.3.Методы6.3.1.Изготовление гибких планарных микроэлектродовметодом лазерной абляцииС поверхности пленки из полиэтилентерефталата при помощи лазераудаляли часть материала в виде полукруглого микроканала сечением ≈ 20х40 мкм.5, 5Эксперименты с использованием сканирующих электронного и лазерного микроскопов проводилисьавтором в процессе стажировки в лаборатории физической и аналитической электрохимии федеральнойполитехнической школы Лозанны (Швейцария).61Затем полученный микроканал заполняли углеродной пастой, формируя стерженьмикроэлектрода сечением в виде полумесяца в соответствии с рис.
18.Рис. 18. Микрофотография поперечного сечения микроэлектрода, стрелкойпоказана углеродная поверхность.После нанесения углеродной пасты электроды прокаливали при 100С втечение 45 мин. Описанную процедуру нанесенияуглеродной пасты споследующим прокаливанием проводили трехкратно. Полученный в микроканалеуглеродныйстерженьсверхузакрывалиприпомощиламинированияполиэтиленовой(ПЭ)/полиэтилентерефталатной(ПЭТФ) пленкой. Для созданияэлектрического контакта с микростержнем часть ламината удаляли вручную и вобласти вершины стержня наносили некоторое количество углеродной пасты длясоздания небольшой контактной области в соответствии с рис. 14.6.3.2.Модификация планарного электрода берлинскойлазурьюИзготовление сенсора для определения Н2О2 на основе планарныхэлектродовпроводилиметодом,разработаннымранеевлабораторииэлектрохимических методов химического факультета МГУ [194] и основанным напоследовательном нанесении на поверхность электрода смеси растворов солижелеза с пероксидом водорода и раствором K3[Fe(CN)6].
Пероксид водорода,используемый в смеси с катионом железа, окисляет поверхность планарного62электрода, образуя отрицательный заряд. Это способствует более сильномусвязыванию катионов железа с поверхностью.Fe3+ + [Fe(CN)6]3- → Fe[Fe(CN)6] + H2O2 → Fe4[Fe(CN)6]3На основе представленной реакции на поверхности образуется комплексFe[Fe(CN)6], который, реагируя с пероксидом водорода, образует БЛ.Осаждение берлинской лазури на поверхность электродов проводили изреакционной смеси состава: 4 мМ FeCl3 и 4 мМ K3[Fe(CN)6] в фоновом электролите0.1 M KCl, 0.1 M HCl.
Смесь предварительно выдерживали в течение 20 мин впробирке Эппендорфа в темноте, затем ее наносили на рабочий электрод (рис. 19).Через 15 мин, в каплю на электроде добавляли пероксид водорода до достиженияконцентрации 100 мМ в капле и выдерживали полученную смесь на электроде втечение 45 мин. На рис. 19 продемонстрировано изменение окраски капли среакционной смесью после добавления пероксида водорода с течением времени.Рис. 19. Изменение окраски капли с реакционной смесью при модификациипланарных электродов берлинской лазурью.По окончании осаждения (по истечении выбранного для выдерживаниякапли времени) поверхность электродов промывали дистиллированной водой.Для оценки эффективности осаждения БЛ проводили активацию электрода(потенциодинамическаяобработкамодифицированногоБЛэлектродавциклическом режиме в фоновом электролите в интервале потенциалов от -0.05 до0.35 В) [99].
После высыхания электроды прокаливали при 100°С в течение часа иохлаждали до комнатной температуры. Сенсоры считались надлежащего качества,если наблюдались следующие аналитические характеристики: коэффициентчувствительности не менее 0.2 А∙М-1∙см-2, линейный диапазон определяемых63концентраций H2O2 не менее 2 порядков, операционная стабильность не менее 60мин.6.3.3.Модификация гибкого планарного микроэлектродаберлинской лазурьюМодификация гибких планарных микроэлектродов берлинской лазурью дляопределения концентрации пероксида водорода проводилась по методике,разработанной ранее в лаборатории электрохимических методов химическогофакультета МГУ [195-197].На поверхности рабочих электродов изготовленных гибких планарныхмикроэлектродов осаждались электрохимически кристаллы берлинской лазури последующей методике.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
