Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Создание проточной тонкослойной ячейкиВ качестве модельной системы при создании неинвазивного монитора, быласконструирована тонкослойная ячейка на поверхности планарного электрода. Дляэтого был изготовлен параллелепипед из органического стекла, содержащийотверстие для штутсера, переходящее в капилляр, чертеж образца приведен на рис.20. Для создания капилляра наповерхности электрода и, тем самым,конструирования тонкослойной ячейки на элемент из органического стеклананосили слой клея, толщиной 100 мкм, оставляя незаклеенную поверхность потрафарету шириной 1 - 1.5 мм. Далее приклеивали электрод к детали такимобразом, чтобы незаклеенная поверхность содержала часть вспомогательногоэлектрода, рабочего и электрода сравнения, оставшуюся липкую часть ячейкигерметично заклеивали пластиком (рис.
21). Края ячейки обрабатывали герметикоми оставляли сушиться на воздухе в течение 20 мин. Таким образом, ячейка69представляла собой капилляр, одной из стенок которого является планарныйэлектрод.Тонкослойную ячейку подключали с одной стороны к перистальтическомунасосу, а с другой к потенциостату с компьютером и проводили измерениямодельных растворов лактата и потовых проб в фосфатном буферном растворе.Рис. 20. Чертеж детали из органического стекла, используемой при созданиипроточной тонкослойной ячейки.Рис.
21. Создание капилляра на поверхности планарного электрода.706.3.15. Разработка конструкции неинвазивного монитора дляопределения лактата в поте в процессе реального времениДля проведения измерений лактата в поте в процессе реального времени,указанная выше тонкослойная ячейка была модифицирована в конструкциюнеинвазивногомонитора,какпоказанонарис.22.Мониторкрепилсянепосредственно на поверхность кожи, образовавшийся пот всасывался в капиллярчерез отверстие 2, заполнял его, и сигнал тока от биосенсора регистрировался наэкране компьютера.Рис.
22. Схема неинвазивного монитора. 1 – основа, 2 – отверстие, 3 –двухсторонний липкий слой, 4 –биосенсор для определения лактата, 5 – покрытиеиз ПЭТФ.6.3.16. Проведение электрофореза для увеличенияпотоотделенияС целью увеличения потоотделения непосредственно перед экспериментомпроводился электрофорез с пилокарпином, стимулирующий выработку пота.
Последующей методике:711) Взятие потовой пробы может быть осуществлено из любого участка телачеловека.2) Для проведения исследований по установлению корреляций принагрузочныхтестахдлявзятияпробыиспользуютчаститела,непосредственно участвующие в нагрузке.3) Доброволец должен сесть и расслабиться.4) Участок для взятия пота протирают спиртом.5) Первый электрод (анод) из углеволокна, обмотанный белой тканью,промокают 1% раствором пилокарпина.
Ткань должна быть пропитанаполностью. Подключают электрод к проводу (в карман белой ткани,которой обмотано углеволокно, кладут кольцо на конце провода так,чтобы графитовая ткань с ним соприкасалась).6) Второй электрод (катод) из углеволокна, обмотанный белой тканью,промокают 0.1 М раствором HCl и KCl. Ткань должна быть пропитанаполностью. Подключают электрод к проводу.7) Для проведения активации кожи для взятия потовой пробы дофизической нагрузки на участок кладут анод контактом вверх (т.е.
когда скожей соприкасается только белая ткань) и фиксируют на конечностиэластичным жгутом.8) На расстоянии приблизительно 50 мм снизу от анода кладут катодконтактом вверх и также фиксируют на конечности при помощиэластичного жгута.9) Прибор «Поток-1» подключают к сети, устанавливают минимальныйпредел плотности тока (5 мкА), а ручку увеличения тока на минимумнагрузки (т.е. до упора против часовой стрелки). В выключенномсостоянии к прибору подключают провода от электродов. Провод отанода к гнезду «+», от катода – к «-».10) Включают прибор «Поток-1». Просят добровольца вращать ручкуувеличения тока по часовой стрелке до того, как человек почувствуетнеприятные ощущения покалывания на коже под катодом.
Последостижения ощущений засечь 15 мин.7211) По истечению 15 мин электрофореза прибор выключают. Жгут,фиксирующий анод ослабляют и вынимают анод. На место него ставятколлектор пота воронкой к коже или тонкослойную ячейку всасывающуюпот с поверхности кожи и фиксируют жгутом. Так же ослабляют ивынимают катод.12) Для проведения активации участка кожи для снятия потовой пробыпосле физической нагрузки повторяют п. 4 - 11.13) По истечении 30 мин жгуты ослабляют, вынимают коллекторы пота ипри помощи дозатора вытягивают собранный пот через входноеотверстие воронки, либо прекращают измерения неинвазивного монитораввиду уменьшения объема пота.14) После проведения процедур, использованные коллекторы пота итонкослойную ячейку промывают избытком воды с помощью шприца.73РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕГлава 7. Высокочувствительный биосенсор для определениялактата на основе лактатоксидазы и мембран с использованиемсилоксана7.1.Получение электродов, модифицированных берлинской лазурьюНа сегодняшний день наиболее эффективными датчиками на пероксидводорода считаются электроды, модифицированные берлинской лазурью, котораяпозволяетизбирательноопределятьпероксидводородапореакцииеговосстановления в присутствии кислорода.
В настоящее время электроды на основеберлинской лазури широко используются при конструировании сенсоров напероксид водорода и биосенсоров, содержащих иммобилизованные оксидазы вкачестве биочувствительного элемента, как в нашей стране, так и за рубежом(например, в США, Китае, Италии, Швеции, Ирландии).Сенсор на основе берлинской лазури имеет следующие аналитическиехарактеристики:высокаячувствительность(1А∙М-1.см-2),низкийпределобнаружения H2O2 (менее 0.01 мкмоль/л), малые времена отклика (менее 30 с наодно измерение в проточно-инжекционном анализе), широкий линейный диапазонизмеряемых концентраций пероксида водорода (0.1 мкмоль/л - 0.1 моль/л H2O2),нечувствительность к присутствию природных восстановителей в анализируемыхобразцах из-за низкого потенциала измерения (0.00 В) и высокая операционнаястабильность (более 1000 измерений) [104].
Высокая операционная стабильностьэлектродов подтверждает тот факт, что неорганический катализатор не смывается споверхности электрода во время работы и делает возможным их использование вкачестве имплантируемых сенсоров для клинического анализа.Для создания сенсоров на пероксид водорода использовали планарныеэлектроды, изготавливаемые методом трафаретной печати, они просты и удобны виспользовании, на единой подложке представлены рабочий, вспомогательный иэлектрод сравнения (рис. 23). Трафаретная печать (screen-printing) – это методпечати графических изображений и текста на различных поверхностях при помощи74специальной формы (трафарета).
Краска наносится на трафарет, затем проникаетсквозь него посредством механического воздействия, ложась на поверхность.Рис. 23. Планарный электрод, изготовленный методом трафаретной печати.Трудоемкость стадий нанесения пленок берлинской лазури на планарныеэлектродыэлектрохимическимиметодамиделаетпредпочтительнымиспользование химических методов, единственно перспективных для массовогопроизводства сенсоров в связи с простотой, дешевизной и воспроизводимостью.Показано,чтометодмежфазногосинтеза,единственныйсредиметодовхимической модификации, позволяет получить электрокаталитические покрытия,лишь немногим уступающие по аналитическим характеристикам синтезированнымэлектрохимически.Модификация поверхности рабочего электрода трехэлектродной планарнойструктуры была осуществлена методом межфазного синтеза берлинской лазурипутем восстановления комплексаFeIII[FeIII(CN)6].
Аналогично пограничнойполимеризации [199], за счет концентрирования реагентов на границе раздела фазстановится возможным осуществлять синтез преимущественно на подложке.Метод пограничной полимеризации не требует ни проводимости подложки, ниналожения внешнего потенциала.Синтез проводился из смеси солей, содержащей Fe3+ и [FeIII(CN)6]3- ионы.Образующийся в этом случае комплекс Fe III[FeIII(CN)6] является сильнымокислителем, поэтому присутствие любых веществ, способных окисляться притаких потенциалах, приведет к осаждению берлинской лазури. Для осуществленияпротекания реакции в объеме раствора в качестве внешнего восстановителякомплекса FeIII[FeIII(CN)6] использовали пероксид водорода.75Для оценки эффективности осаждения проводили активацию электродаметодом потенциодинамической обработки модифицированного БЛ электрода вциклическом режиме в фоновом электролите в интервале потенциалов от -0.05 до0.35 В.
Циклическая вольтамперограмма (ЦВА) представлена на рис. 24, высокиепики окислительно-восстановительного перехода берлинской лазури в берлинскийбелый и их близкое расположение по оси потенциалов свидетельствуют орегулярной структуре неорганического поликристалла [94], которая обеспечиваетстабильность, селективность [200], а также низкие шумы получаемого датчика.20I, мкА100-10-20-1000100200300400E, мВРис.
24. Циклическая вольтамперограмма активации берлинской лазури напланарном электроде в растворе 0.1 М KCl, 0.1 M HCl, скорость развертки 40 мВ/с.На циклической вольтамперограмме видны два симметричных пикаокисления-восстановления БЛ, при этом разница между этими пиками, равная 0.05В, меньше, чем аналогичная величина для БЛ, синтезированной лучшим изизвестных химических методов (~ 0.10 В [201]), что свидетельствует о высокойрегулярности структуры полученной пленки.На электроде, модифицированном БЛ, определяли пероксид водорода всистеме ПИА, для этого инжектировали модельные растворы Н2О2 в диапазонеконцентраций: 1.10-7 – 5.10-3 М в буферном растворе. На основании полученныхданных строили градуировочный график (рис.
25).76010-1-2-210j, мА смj, мАсм-2100.02-3100.01C (H2O2), M-4100.0-710-610-510-410С(H2O2), M-55.0x10-41.0x10-310Рис. 25. Градуировочный график для определения пероксида водорода в системепроточно-инжекционного анализа с помощью сенсора на основе берлинскойлазури. Буферный раствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В (n= 3, P = 0.95).Из градуировочной зависимости определяли аналитические характеристикисенсора, которые представлены в табл. 3.Таблица 3.
Аналитические характеристики сенсора на пероксид водорода всистеме проточно-инжекционного анализа (n = 10, P = 0.95)Сенсор для определенияКоэффициентЛинейный диапазонпероксида водородачувствительности,определяемых концентрацийА∙М-1∙см-2H2 O2 , МЭлектроды,модифицированные БЛ0.6 ± 0.11.10-7 ÷ 1.10-3Таким образом, подготовлены электроды для определения пероксидаводорода, характеризующиеся высокой чувствительностью и широким диапазономопределяемых концентраций.
Берлинская лазурь является высокоэффективнымкатализатором восстановления пероксида водорода и может выступать в качестветрансдьюсера при создании лактатных биосенсоров.777.2.Использование силоксана для иммобилизации фермента наповерхность планарных электродов, модифицированных берлинской лазурьюИммобилизация фермента на поверхности электрода является важнейшейстадией создания биосенсора.
Наиболее широко используется в литературепринципвключенияферментавполимерныемембраны.Приэтомпредпочтительно использовать раствор уже готового полимера, избегая проведенияреакции полимеризации в ферментсодержащей рабочей смеси. Упрощениепроцесса получения биосенсоров позволяет добиться высокой воспроизводимости,что является необходимым условием для их массового производства.Биосенсоры используют для работы в водной среде, поэтому дляиммобилизации фермента необходимо применять водонерастворимые мембраны.Полимеры, образующие такие мембраны, растворяются только в органическихрастворителях.
Таким образом, при смешивании фермента и полимера нельзяизбежать контакта белка с органическим растворителем. Детальное исследованиеповедения ферментов в средах с низким содержанием воды началось около 15 летназад и получило название «неводная энзимология». Было показано, большинствоферментов довольно стабильны в смесях с содержанием воды 10 - 15% [153].В лаборатории электрохимических методов химического факультета МГУбыл разработан способ иммобилизации ферментов в пленки нерастворимогополимера на поверхности трансдьюсера, заключающийся в экспонированиифермента в концентрированный органический растворитель, смешивании его систинным раствором полимера, нанесении на поверхность трансдьюсера ивысушивании [153]. Эта идеология успешно была применена при созданиимембранизперфторсульфонированногополимера,содержащихиммобилизованную глюкозооксидазу, при разработке глюкозного биосенсора[198].В качестве растворителя при иммобилизации лактатоксидазы использовалсяизопропиловый спирт, ферментсодержащую водно-органическую смесь наносилинапланарныйэлектрод,модифицированныйБЛ.Привысыханиисмесипроисходило испарение органического растворителя, и на поверхности оставаласьферментсодержащая мембрана регулярной структуры, благодаря небольшому78содержанию воды.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
