Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Содержание силоксана в смеси для иммобилизации фермента (слеванаправо): 0.3%, 0.9%, 1.5%, 2.8%.Тѐмно-синие участки на рис. 38 соответствуют высоким значениям катодныхтоков, демонстрируя, таким образом, участки подложки, где происходит генерацияпероксида водорода в результате ферментативной реакции, красные участкисоответствуют нулевым значениям токов, зеленые – переходным; отчетливо видныобласти нанесения четырех мембран. Необходимо заметить, что, несмотря напроведение эксперимента по получению изображения в течение 10 ч, наблюдаетсялокальный контраст с точностью до десятков микрон между областями генерациии областями проникновения пероксида водорода в результате диффузии, чтоговорит о высокой точности данного метода получения изображения.
Мембрана ссодержанием силоксана 0.3% использовалась для сравнения, так как биосенсор наеѐ основе превосходил по аналитическим характеристикам существующие аналоги.93Однако, при использовании силоксана в широком диапазоне содержаний видно,чтоданнаямембранадемонстрируетнаименьшийсигнал,анаивысшейферментативной активностью обладает ЛОД в смеси, содержащей 1.5% силоксана.Сравнительно хороший результат доятигается также при использовании 0.9%силоксана, чуть хуже с применением 2.8% силоксана.Идентичный эксперимент был воспроизведен на квадратной подложке,линейное сканирование проб по двум рядам представлено на рис. 39.
Такженаблюдается увеличения катодных токов при прохождении зондом вдоль капельЛОД. На рис. 39 (1) от -4000 до -2000 мкм по оси Х виден сигнал от фермента в0.3% силоксане, от -2000 до -500 мкм – с использованием 0.9% силоксана, сигналыот мембран плохо разделены и наблюдаются низкие значения токов, что можнообъяснить тем, что сканирование проводилось не по центру капель. На рис. 39 (2)отчетливо наблюдаются сигналы от двух ферментсодержащих мембран.Для получения СЭХМ-изображения подложки с ферментсодержашимимембранами была выбрана область размером 4х4 мм (рис.
40). Установленныйрабочий потенциал для амперометрической детекции 0.00 В, скорость линейногосканирования 50 мкм/с, шаг по оси Х 50 мкм, расстояние между областямилинейного сканирования было установлено в 50 мкм, что соответствуетприблизительной ширине электрода.021-2I, нАI, нА-1-4-2-6-4000-3000-2000x, мкм-10000-4000-3000-2000-10000x, мкмРис. 39. Линейное сканирование четырех ферментсодержащих силоксановыхмембран в растворе 50 мМ лактата в буферном растворе; скорость 50 мкм/с, шаг 50мкм, hP = -100 мкм, потенциал 0.00 В. Содержание силоксана в смеси дляиммобилизации фермента (слева направо): 1 - 0.3%, 0.9%, 2 - 1.5%, 2.8%.y, мкм94I, нАx, мкмРис.
40. Изображение участка подложки с ферментсодержащими силоксановымимембранами в растворе 50 мМ лактата в буферном растворе; скорость 50 мкм/с,шаг по Х 50 мкм, шаг по Y 50 мкм, hP = -100 мкм, потенциал 0.00 В.Красные участки на рис. 40 соответствуют высоким значениям катодныхтоков, синие – нулевым значениям, а зеленые – промежуточным; отчетливонаблюдаются области расположения четырех мембран. Видно, что лактатоксидазав смеси из 1.5% силоксана обладает наивысшей ферментативной активностью, иобразец с использованием 0.3% силоксана демонстрирует наименьший сигнал, посравнению со всеми представленными, что подтверждает результаты, полученныев первом эксперименте (рис.
38). Но, можно заметить, что в данном образцефермент, иммобилизованный в смесь, содержащую 2.8% силоксана, обладаетчувствительностью выше, чем 0.9%, что противоречит результатам, полученнымпо первому образцу (рис. 38). Можно предположить, что ферментативнаяактивность ЛОД при иммобилизации в смеси, содержащие 0.9% и 2.8% силоксанасхожа по величине.95Таким образом, сканирующая электрохимическая микроскопия позволилабыстро и результативно оценить изменение ферментативной активности ЛОД прииммобилизации в смеси с различным содержанием силоксана. Предполагалось, чтобиосенсоры на основе мембран, обладающих наивысшей ферментативнойактивностью, будут обладать наилучшими аналитическими характеристиками.
Дляподтвержденияполученныхрезультатовбылонеобходимопровестииммобилизацию фермента в смеси силоксана на поверхность планарныхэлектродов, модифицированных БЛ, и протестировать полученные биосенсоры налактат, что описано в следующей главе.7.4.Лактатные биосенсоры на основе ферментсодержащихсилоксановых мембран различной плотностиС помощью сканирующей электрохимической микроскопии была изученаферментативная активность лактатоксидазы при иммобилизации в смеси силоксанавширокомдиапазонесодержаний.Максимальнаяактивностьферментанаблюдалась при использовании 1.5% силоксана для иммобилизации ЛОД. Данныерезультаты подтвердились при тестировании лактатных биосенсоров, на основепланарных структур, модифицированных БЛ с иммобилизованным ферментом вмембраны силоксана.
В табл. 4 приведены аналитические характеристикибиосенсоров для определения лактата. На рис. 41 наглядно представленазависимость коэффициента чувствительности биосенсоров для определениялактата (S) от содержания силоксана в иммобилизующей смеси.В табл. 4 и на рис. 41 видно увеличение чувствительности на участке от 0.1до1.5%силоксана,оптимумнаблюдаетсявдиапазоне1.3-2.2%виммобилизующей смеси, использование более высоких содержаний силоксанаведет к понижению чувствительности. Максимальные значения коэффициентачувствительности наблюдаются в диапазоне концентраций содержания силоксанаот 1.3 до 2.2% в иммобилизующей смеси, однако в качестве лучшего был отмеченбиосенсор с использованием 1.5% раствора для иммобилизации, как обладающийнаиболее широким диапазоном определяемых концентраций лактата 1·10-6 - 5·10-3М, а также наилучшей стабильностью и воспроизводимостью.96Таблица 4.
Аналитические характеристики биосенсоров для определения лактатана основе γ-аминопропилсилоксана (n = 10, P = 0.95)СодержаниесилоксанаЛинейный диапазонв определяемыхсмеси, об.%Коэффициентсmax, мMчувствительности,KМ, мMмA∙M-1·cм-2концентраций, M0.11·10-5 - 5·10-4531 ± 50.6 ± 0.10.25·10-6 - 5·10-4550 ± 40.5 ± 0.10.35·10-6 - 5·10-4562 ± 230.6 ± 0.30.41·10-5 - 5·10-4565 ± 100.4 ± 0.10.55·10-6 - 5·10-45125 ± 380.3 ± 0.10.65·10-6 - 5·10-45107 ± 540.5 ± 0.20.75·10-6 - 5·10-45130 ± 420.4 ± 0.20.85·10-6 - 5·10-45111 ± 630.4 ± 0.10.855·10-6 - 5·10-45125 ±530.4 ± 0.10.91·10-6 - 5·10-45164 ± 1190.4 ± 0.11.01·10-6 - 5·10-45183 ± 960.3 ± 0.11.25·10-6 - 5·10-45175 ± 830.3 ± 0.11.31·10-6 - 5·10-45229 ± 620.3 ± 0.11.51·10-6 - 5·10-45261 ± 970.3 ± 0.11.75·10-6 - 5·10-45158 ± 1000.3 ± 0.11.85·10-6 - 5·10-45266 ± 1210.2 ± 0.12.05·10-6 - 5·10-45263 ± 950.3 ± 0.12.25·10-6 - 5·10-41248 ± 1170.4 ± 0.12.45·10-6 - 5·10-41185 ± 250.4 ± 0.12.85·10-6 - 5·10-45136 ± 780.4 ± 0.13.05·10-6 - 5·10-45113 ± 740.3 ± 0.1Данные, полученные при тестировании лактатных биосенсоров, полностьюсогласуются с результатами, показанными с использованием СЭХМ.
На рис. 41видно, что наивысшей чувствительностью обладает датчик с содержаниемсилоксана в смеси 1.5%, а также биосенсор с 0.3% содержанием силоксанаобладаетнаименьшейчувствительностью,относительнорассмотренныхс97помощьюСЭХМ.Биосенсорыссодержаниемсилоксанавсмесидляиммобилизации фермента 0.9% и 2.8% с учетом погрешности показываютприблизительно одинаковые значения коэффициента чувствительности, чтообъясняет расхождение в показателях ферментативной активности между первым ивторым образцом, которые были показаны на рис. 35 и 40.
Стоит заметить, чточувствительность биосенсоров при использовании 1.3 – 2.2 % силоксана в смесидля иммобилизации фермента увеличена в четыре раза по сравнению счувствительностью лучшего лактатного датчика, с применением 0.3% силоксана.300-1S, мАМ см-24002001000.0Рис.41.0.5Зависимость1.01.52.0NH2Sil, %коэффициента2.53.0чувствительностибиосенсоровдляопределения лактата от содержания силоксана в иммобилизующей смеси дляфермента (n = 10, P = 0.95).В табл. 4. приведены значения кажущейся константы Михаэлиса ферменталактатоксидазы при использовании различных смесей для иммобилизации.Кажущаяся константа Михаэлиса Км - кинетический параметр ферментативнойреакции, численно равный концентрации субстрата, при которой скорость реакциисоставляет половину максимальной. Км характеризует сродство фермента ксубстрату: чем меньше значение константы, тем сильнее связывание фермента ссубстратом [202-207].
Такие ферменты, как карбоангидраза и каталаза, требуютотносительно высокой концентрации субстрата для достижения скорости, равной98половине максимальной. Другие же ферменты, например гексокиназа мозга,катализирующая перенос фосфатной группы от аденозинтрифосфата на глюкозу,обеспечивают скорость, равную половине максимальной, при очень низкойконцентрации субстрата. Ферменты, имеющие два или более субстрата, такие какгексокиназа или аспартатамино-трансфераза, могут иметь различные значенияКм для разных субстратов. Если фермент, например химотрипсин, действует нанесколькоразныхсубстратов,имеющихкакую-тообщуюструктурнуюособенность, то величины Км для всех этих субстратов могут значительноразличаться. Этот параметр введен Леонором Михаэлисом в 1913 году.Кинетика большинства ферментативных реакций может быть формальноописана при помощи уравнения Михаэлиса-Мэнтен.
На рис. 42 показаназависимость начальной скорости ферментативной реакции от концентрациисубстрата при постоянной концентрации фермента. Из экспериментальных данныхо скорости реакции при различных начальных концентрациях субстрата можноопределить кинетические параметры Kм (кажущуюся) и Vм (кажущуюся).VVM1/2 VMKМРис.42.Зависимость[S]начальнойскоростиферментативнойреакцииотконцентрации субстрата при постоянной концентрации фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
