Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Криваяприближения зонда приведена на рис. 60.1210.0-0.5I, нА-1.0-1.5-2.0-2.50200400600800z, мкмРис. 60. Кривая приближения зонда в растворе 5 мМ лактата в буферном растворе(по оси абсцисс отложено расстояние, пройденное зондом, по оси ординат – ток).Скорость 1 мкм/с, шаг 0.5 мкм, потенциал 0.00 В.На кривой приближения (рис. 60) видно увеличение катодного тока от 300 до900 мкм по оси Z, после чего наблюдается точка перегиба, соответствующаярасстоянию, на котором микроэлектрод коснулся поверхности, далее зонд начинаетизгибаться, что обусловливает последующее уменьшение тока.-0.3I, нА-0.4-0.5-0.6-0.7-9000-6000-30000x, мкмРис. 61.
Линейное сканирование четырех ферментсодержащих мембран в растворе5 мМ лактата в буферном растворе; скорость 50 мкм/с, шаг 50 мкм, hР = -100 мкм,122потенциал 0.00 В. Смесь для иммобилизации фермента содержала (слева направо):0.4% силоксана и 0.2% ПФС, 1% силоксана и 0.5% ПФС, 1% силоксана и 1% ПФСи последняя: 0.4% силоксана и 0.6% ПФС.Линейное сканирование подложки с нанесенными ферментсодержащимимембранамиотчетливодемонстрируетувеличениекатодноготокаприпрохождении вдоль капель (рис.
61).Подложка с нанесенными ферментсодержащими мембранами находилась врастворе 5 мМ лактата в буферном растворе для последующего сканированияэлектрохимической активности поверхности в режиме коллекции-генерации, былавыбрана область размером 11.0х1.2 мм. Для амперометрической детекции былустановлен рабочий потенциал 0.00 В, скорость линейного сканирования 50 мкм/с,шаг по оси Х 50 мкм, расстояние между областями линейного сканирования былоустановлено в 50 мкм, что соответствует приблизительной ширине электрода.y, мкмx, мкмI, нАРис.
62. СЭХМ-изображение четырех ферментсодержащих мембран в растворе 5мМ лактата в буферном растворе; скорость 50 мкм/с, шаг по Х 50 мкм, шаг по Y 50мкм, hР = -100 мкм, потенциал 0.00 В. Смесь для иммобилизации ферментасодержала (слева направо): 0.4% силоксана и 0.2% ПФС, 1% силоксана и 0.5%ПФС, 1% силоксана и 1% ПФС и последняя: 0.4% силоксана и 0.6% ПФС.На рис. 62 видно, что первые три пробы демонстрируют приблизительноодинаковый сигнал, то есть наблюдаются близкие значения ферментативнойактивности и, как следствие, чувствительности лактатных биосенсоров прииспользовании данных иммобилизующих смесей. Однако наблюдается оченьслабый сигнал от мембраны с использованием смеси для иммобилизации 0.4%123силоксана и 0.6% ПФС.
Это можно объяснить тем, что соотношение силоксана иПФС в данном случае сдвинуто в сторону ПФС, что значительно понижаетсродство фермента к субстрату и, как следствие, ферментативную активность.Таким образом, из данных СЭХМ можно сделать вывод, что в зависимостиотсоотношениясилоксанаиперфторсульфонированногополимеравиммобилизующей смеси меняется сродство фермента к субстрату и, как следствие,изменяютсялактатныхферментативнаябиосенсоровнаактивностьосновеиданныханалитическиесмесейдляхарактеристикииммобилизациилактатоксидазы.8.6.Использование смешанных мембран для иммобилизациилактатоксидазы при создании лактатных биосенсоровКажущаяся константа Михаэлиса Км характеризует сродство фермента ксубстрату: чем меньше значение константы, тем сильнее связывание фермента ссубстратом [202-207].
Как уже было описано в § 7.4, кинетика большинстваферментативных реакций может быть формально описана при помощи уравненияМихаэлиса-Мэнтен, а кажущаяся константа Михаэлиса Км может использоватьсядля оценки верхней границы диапазона определяемых концентраций биосенсора.КонстантаМихаэлисаЛОДприиммобилизациивблагоприятныеэлектронейтральные для фермента мембраны силоксана может варьироваться от0.24 (при содержании силоксана в смеси - 1.8%) до 0.62 мМ (0.1% силоксана) какбыло описано в § 7.4.
Однако, при иммобилизации фермента в смешанныемембраны, значение Км может увеличиваться вплоть до 10 мМ, то есть возрастатьв 30 раз, что говорит о существенном понижении сродства фермента к субстрату.На рис. 63 показана зависимость плотности тока от концентрации лактата прииммобилизации фермента в силоксановую мембрану (левая ветвь), при этом Км1 =0.24 мМ и смешанную (правая ветвь), когда Км2 = 9 мМ. Видно, что диапазонопределяемых концентраций лактата при использовании смешанных мембрансдвигается в область высоких значений на два порядка.
Эмпирические данныехорошо ложатся на гиперболу, расчет константы происходил исходя из уравнениягиперболы, которое имеет вид:124,где Км – кажущаяся константа Михаэлиса, J – максимальное значение плотноститока, а [S] – концентрация лактата.j, мкАсм-2101KM1-510-410KM2-310-210Слактата, MРис. 63. Сравнительный график, демонстрирующий разницу в значенияхкажущейся константы Михаэлиса фермента, при иммобилизации в смешанную(Км2) и силоксановую (Км1) мембрану.При создании биосенсоров варьировали содержание силоксана и ПФС виммобилизующей смеси для фермента: силоксана от 0.01 до 5.00 об.%, ПФС от0.10 до 8.50 об.%. При тестировании биосенсоров было выявлено, что искомыйдиапазон определяемых концентраций лактата от 0.1 до 50, а в некоторых случаяхдаже до 80 мМ в batch-режиме, а вместе с тем максимальные значения константыМихаэлиса наблюдается при определенных соотношениях силоксан:ПФС виммобилизующей смеси (рис.
64). Аналитические характеристики биосенсоровприведены в табл. 8, жирным шрифтом выделены характеристики датчиков,представляющих наибольший интерес за счет достижения максимального сдвигадиапазона определяемых концентраций лактата. На рис. 64 приведена диаграммазависимости кажущейся константы Михаэлиса от содержания силоксана и ПФС виммобилизующей смеси.125Таблица 8.
Аналитические характеристики биосенсоров для определения лактатанаосновесмешанныхмембранγ-аминопропилсилоксанаиперфторсульфонированного полимера в batch-режиме (n = 5, P = 0.95)СодержаниеСодержание Линейныйсилоксана в ПФСсмеси, %в диапазонсмеси, %12концентраций, Mсmax,S,мMмA∙M-1∙см-24Kм, мМ0.200.1035·10-5 - 1·10-310513 ± 361.4 ± 0.50.200.305·10-4 - 1·10-310-505±12.8 ± 0.60.300.105·10-5 - 5·10-45110 ± 200.3 ± 0.10.300.155·10-5 - 5·10-41020 ± 61.2 ± 0.40.300.301·10-5 - 1·10-3566 ± 231.5 ± 1.00.300.401·10-5 - 1·10-31027 ± 91.3 ± 0.90.400.155·10-5 - 1·10-31030 ± 80.6 ± 0.30.400.201·10-4 - 1·10-3500.7 ± 0.22±10.400.305·10-5 - 1·10-3104±11.6 ± 0.80.400.405·10-5 - 1·10-31012 ± 51.3 ± 0.90.400.501·10-5 - 1·10-3548 ± 120.4 ± 0.20.400.605·10-5 - 1·10-31011 ± 51.5 ± 0.40.500.251·10-5 - 1·10-310110 ± 260.4 ± 0.20.500.305·10-5 - 1·10-3309±51.3 ± 0.80.500.405·10-5 - 1·10-3521 ± 70.9 ± 0.40.600.305·10-5 - 1·10-31027 ± 80.8 ± 0.20.600.405·10-5 - 1·10-31012 ± 40.7 ± 0.30.600.905·10-4 - 5·10-3103±11.3 ± 0.40.800.405·10-5 - 5·10-41061 ± 50.6 ± 0.20.800.505·10-4 - 5·10-33020 ± 121.5 ± 1.20.900.455·10-4 - 5·10-3104±20.9 ± 0.30.900.605·10-5 - 5·10-33010 ± 52±10.900.705·10-5 - 1·10-31018 ± 50.7 ± 0.30.900.805·10-5 - 1·10-31016 ± 51.1 ± 0.5126120.900.9035·10 - 1·10-31.000.401·10-4 - 1·10-3552 ± 100.4 ± 0.11.000.505·10-5 - 1·10-33013 ± 92±11.000.605·10-5 - 1·10-31038 ± 110.6 ± 0.31.000.705·10-5 - 1·10-3524 ± 90.9 ± 0.41.000.805·10-5 - 1·10-3510 ± 60.9 ± 0.31.000.905·10-5 - 5·10-41016 ± 61.4 ± 0.61.001.005·10-5 - 1·10-31017 ± 92±11.001.201·10-4 - 5·10-330-501.1 ± 0.53±21.001.505·10-5 - 1·10-3104±20.6 ± 0.41.003.00----1.100.705·10-5 - 1·10-3108±42±11.200.405·10-5 - 1·10-352±10.4 ± 0.11.200.705·10-4 - 5·10-3105±41.1 ± 0.51.201.00----1.201.20----1.400.705·10-4 - 1·10-351.2 ± 0.50.4 ± 0.11.501.505·10-4 - 5·10-3100.8 ± 0.32±11.502.001·10-4 - 5·10-330-501.1 ± 0.93±11.502.501·10-4 - 5·10-330-501.8 ± 0.24±21.503.005·10-4 - 1·10-3300.6 ± 0.34±21.503.50----1.800.605·10-4 - 1·10-350.5 ± 0.20.4 ± 0.11.800.905·10-4 - 1·10-3516 ± 70.4 ± 0.11.801.001·10-4 - 1·10-31017 ± 91.1 ± 0.51.801.201·10-4 - 1·10-31015 ± 61.1 ± 0.52.001.001·10-4 - 1·10-31010 ± 60.4 ± 0.12.001.201·10-4 - 1·10-3553 ± 110.4 ± 0.12.001.501·10-4 - 1·10-355±11.2 ± 0.62.003.001·10-4 - 5·10-3500.4 ± 0.24±2-44Продолжение таблицы 7561.2 ± 0.40.6 ± 0.210127Продолжение таблицы 7122.601.5031·10 - 5·10-342.603.001·10-4 - 5·10-350.6 ± 0.10.8 ± 0.32.64.00----3.005.001·10-4 - 1·10-250-801.2 ± 0.510 ± 33.005.50----4.006.501·10-4 - 5·10-330-501.9 ± 0.44±35.008.501·10-4 - 5·10-3102±11.7 ± 0.2-4553±160.7 ± 0.2Примечания:«-« отклика не наблюдалось.1084сило4KM , мM623ксан2,%101234ПФС,56 0%Рис.
64. Трехмерная диаграмма зависимости константы Михаэлиса от содержаниясилоксана и перфторсульфонированного полимера в иммобилизующей смеси длялактатоксидазы при создании лактатных биосенсоров.Зависимость кажущейся константы Михаэлиса от содержания силоксана иПФС в иммобилизующей смеси представляет собой подобие горного хребта,максимумы наблюдаются при определенных соотношениях силоксан:ПФС, на128начальном участке 2:1, далее 1:1, а ближе к концу 2:3.
На рис. 64 синим цветомпоказаны низкие значения Kм. При высоких содержаниях ПФС и низких –силоксана наблюдается деактивация ЛОД по причине блокирования ферментаотрицательным зарядом ПФС. При высоких содержаниях силоксана и низких –ПФС маленькие значения Kм объясняются высоким сродством фермента ксубстрату, так как силоксан образует благоприятную электронейтральную средудля фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
