Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Время отклика порядка40 с, коэффициент чувствительности биосенсора, измеряемый как тангенс угланаклона начальной части градуировочной зависимости, составляет 0.33·A·M-1·cм-2.Чувствительность разработанного биосенсора в четыре раза превышает значениелучшего высокочувствительного датчика на лактат, с использованием смеси 0.3%силоксана для иммобилизации [50]. Также стоит заметить, что данное значение106только в два раза меньше, чем чувствительность датчика трансдьюсера на пероксидj, мкА∙см-2водорода берлинской лазури [108], что является очень хорошим результатом.время, сРис. 49. Отклик биосенсора при определении лактата в batch-режиме припостроении градуировочной зависимости (смесь для иммобилизации ферментасодержала 1.5% силоксана).-210j, мкАсмj, мкАсм-2100302010Слактата, мкM10-610-51030-410Слактата, M6090-310Рис. 50. Градуировочный график для определения лактата в batch-режиме приперемешивании (смесь для иммобилизации фермента содержала 1.5% силоксана).Буферный раствор 0.1 M KCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В (n = 3, P =0.95).107Для определения операционной стабильности датчика были проведеныэксперименты в batch-режиме при постоянном перемешивании в растворе 5·10-4 Млактата(рис.51).Измеренияпроводилисьсиспользованиемвысокихконцентраций лактата, что представляет собой довольно жесткие условия, так какпродукт восстановления H2O2 – гидроксил-ионы – растворяют берлинскую лазурь[200], и чем концентрированнее раствор лактата, тем больше образуется пероксидаводорода, и тем быстрее смывается покрытие пленок БЛ.
И, таким образом,длительные эксперименты в концентрированных растворах лактата приводят кбыстрой потере отклика, однако, после 2 ч непрерывных измеренийприпостоянном перемешивании в batch-режиме разработанный биосенсор сохраняет85% от первоначального отклика, как видно на рис. 51. Спустя 4 ч непрерывныхизмерений обеспечивается по крайней мере 50% от исходного значения тока, чтопредставляет собой высокую операционную стабильность в сравнение сбиосенсорами, при иммобилизации фермента в смеси 0.3% и 2.8% силоксана (рис.52), где датчики теряют 50% отклика спустя 2 ч.
Биосенсор с составом смеси 0.9%силоксана показал высокую операционную стабильность, сохраняя 50% откликапосле 5 ч непрерывной работы (рис. 53). Сравнение операционной стабильностибиосенсоров для определения лактата на основе силоксана представлено в табл. 6.j, мАсм-2302010012678время, чРис. 51.
Операционная стабильность биосенсора при определении лактата в batchрежиме при постоянном перемешивании раствора 5·10-4 М лактата в буферномрастворе (pH 6.0, смесь для иммобилизации фермента содержала 1.5% силоксана).10816j, мкАсм-2j, мкАсм-212912630.0840.51.03.03.504.0время, ч0.51.03.0время, ч3.54.0Рис. 52. Операционная стабильность биосенсоров при определении лактата в batchрежиме при постоянном перемешивании раствора 5·10-4 М лактата в буферномрастворе (рН 6.0, содержание силоксана в иммобилизующей смеси для фермента:слева - 0.3%, справа - 2.8%).25j, мкАсм-22015105012313время, ч1415Рис.
53. Операционная стабильность биосенсора для определения лактата в batchрежиме при постоянном перемешивании раствора 5·10-4 М лактата в буферномрастворе (смесь для иммобилизации фермента содержала 0.9% силоксана).109Таблица 6. Сравнение операционной стабильности биосенсоров для определениялактата на основе силоксановых мембран (n = 3, P = 0.95)Содержание силоксана в смеси,0.30.91.52.81.1 ± 0.31.6 ± 0.32.0 ± 0.21.0 ± 0.22.0 ± 0.45.0 ± 0.54.0 ± 0.22.0 ± 0.4об.%Время потери 15% отпервоначального отклика, чВремя потери 50% отпервоначального отклика, чТакже была протестирована стабильность при хранении, для этогозапечатанные в конверты биосенсоры хранились в холодильной камере при +4ºС.После хранения биосенсоров в течение 18 мес они были протестированы в batchрежиме, отклик биосенсора показан на рис.
54. Наблюдаются маленькие значенияфоновых токов, ровный стабильный сигнал и требуемые соотношения междуисследуемыми концентрациями. Биосенсор тестировали в модельных растворахлактата трехкратно, на основании чего строили градуировочный график ирассчитывали аналитические характеристики.-6510 110-50-5510j, мкАсм-2-10-4110-20-4510-30-3110-400200400600800время, сРис. 54. Отклик биосенсора для определения лактата после хранения в течение 18мес (смесь для иммобилизации фермента содержала 1.5% силоксана) в batch-110режиме при построении градуировочной зависимости. Буферный раствор 0.1 MKCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В.-2151015j, мкА смj, мкАсм-2100Слактата, М-5-45.0x10-510-4101.0x10-310Слактата, MРис. 55.
Градуировочный график для определения лактата в batch-режиме приперемешивании после хранения биосенсора в течение 18 мес (смесь дляиммобилизации фермента содержала 1.5% силоксана). Буферный раствор 0.1 MKCl, 0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В (n = 3, P = 0.95).Коэффициент чувствительности биосенсоров после длительного хранения,рассчитанный как тангенс угла наклона начальной части градуировочнойзависимости, составил 0.13 ± 0.06 A·M-1·cм-2 (n = 3, P = 0.95), а диапазонопределяемых концентраций лактата почти три порядка от 5·10-6 до 1·10-3 М. Изчего можно сделать вывод, что даже спустя 18 мес хранения биосенсор стабильноработает и лишь незначительно теряет в аналитических характеристиках,сохраняется по крайней мере 80% от исходного значения чувствительности.Данный факт достоин внимания, особенно ввиду того, что фермент ЛОД являетсяодной из наиболее лабильных оксидаз и создание условий для длительногосохранения активности и стабильности фермента является сложной задачей,которая была решена путем нахождения оптимального состава смеси дляиммобилизации фермента на поверхности высокоэффективного трансдьюсера.111Такимобразом,разработанбиосенсордляопределениялактата,характеризующийся коэффициентом чувствительности 0.33·A·M-1·cм-2, высокойоперационной стабильностью, а также стабильностью при хранении как минимум18 мес, время отклика биосенсора составило 40 с.
После двух часов непрерывнойработы сохраняется по крайней мере 85% от первоначального отклика. Биосенсорпоказывает улучшение характеристик относительно ранее признанного лучшеголактатного датчикачувствительностистабильности - в два раза.- в четыре раза, а операционной112Глава 8. Биосенсор для определения высоких (миллимолярных)концентраций лактата8.1.Методы сдвига диапазона определяемых концентраций в областьвысоких значенийЦелью данных исследований является разработка неинвазивных методовмониторингалактата.Ранеебылапоказанакорреляцияпоувеличениюконцентрации лактата в крови и в поте [11, 77, 83]. Именно поэтому былонеобходимо разработать биосенсор для определения лактата в неразбавленном потес целью дальнейшего конструирования ненвазивного монитора состояниягипоксии, проводящего непрерывные измерения уровня лактата в процессефизических нагрузок.Концентрация лактата в поте в состоянии покоя и в процессе физическихнагрузок по различным источникам варьируется от 4 до 80 мМ [11, 84, 86].
Длянепрерывного мониторинга лактата в поте было необходимо создать биосенсор навысокие (миллимолярные) концентрации лактата. Для этого за основу был взятсозданный в настоящей работе биосенсор (§ 7), характеризующийся диапазономопределяемых концентраций лактата от 1∙10-6 до 5∙10-3 М. Более высокиесодержания аналита не могут быть определены с помощью данного биосенсора попричине лимитирования по второму субстрату реакции – кислороду (как известно,концентрация молекулярного кислорода в буферном растворе при нормальныхусловиях составляет 0.25 мМ).Были рассмотрены известные способы расширения диапазона определяемыхконцентраций в область высоких значений, а именно: изменение плотности мембранообразующего соединения (в данномслучае концентрации силоксана в иммобилизующей смеси); изменениеаффинности(сродства)ферменталактатоксидазыксубстрату (лактату).Как было рассмотрено в § 7, первый способ не даѐт сдвига диапазонаопределяемых концентраций больше, чем в 5 раз, чего не достаточно, так кактребуемые диапазоны различаются более чем в 100 раз.113Было решено понизить аффинность ЛОД к субстрату путем инженериилактатоксидазы при ее иммобилизации.
Из литературных источников известно, чтов активном центре лактатоксидазы присутствуют два положительно заряженныхаргининовых остатка Arg181 и Arg268. Остатки аргинина расположены внепосредственной близости от кофактора флавинмононуклеотида и вероятноявляются частью субстрат-связывающего участка фермента [134-136]. В настоящейработебылопредложеноэкранироватьсубстрат-связывающийучастокотрицательным зарядом, и, благодаря чему добиться увеличения значениякажущейся константы Михаэлиса. При понижении сродства фермента к субстратуожидался сдвиг диапазона определяемых концентраций лактата в область болеевысоких значений.Ранее,напримереглюкозооксидазы,былопоказано,чтоперфторсульфонированный полимер (ПФС – отечественный аналог нафиона)является хорошим мембранообразующим соединением и на его основе был созданглюкозный биосенсор [198].
Доказано, что при иммобилизации образуетсякомплекс полиэлектролита с ферментом, к преимуществам данного полимераможно отнести водонерастворимость, биосовместимость, а также высокую степеньадгезии к поверхности и низкую набухаемость в водных растворах.Таким образом, для создания биосенсора на высокие концентрации лактатабыло предложено понизить сродство фермента к субстрату путем экранированиясубстрат-связывающегоучасткаЛОД.Дляэтогодляиммобилизациилактатоксидазы было решено использовать перфторсульфонированный иономер,который содержит отрицательно заряженные сульфогруппы.8.2.Использование перфторсульфонированного полимера дляиммобилизации лактатоксидазы при создании биосенсоров для определениялактатаИммобилизацию ЛОД в мембраны из перфторсульфонированного полимерапроводили по ранее разработанной методике, заключающейся в смешиванииводного раствора фермента со спиртовым раствором ПФС, в нашем случаеиспользовали изопропанол.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
