Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Содержание воды в иммобилизующей смеси, как иранее,составляло10%.Биосенсорыпредставлялисобойпланарные114трехэлектродные структуры, модифицированные БЛ с иммобилизованной ЛОД вмембрану ПФС.Содержание ПФС в иммобилизующей смеси для фермента варьировалось от0.2 до 1.0 об.%. Биосенсоры тестировались с использованием системы проточноинжекционного анализа и в batch-режиме, аналитические характеристики прииспользовании ПИА приведены в табл.7.Таблица 7.
Аналитические характеристики лактатных биосенсоров на основеперфторсульфонированного полимера, протестированные в системе проточноинжекционного анализа (n = 5, P = 0.95)Содержание ПФС вКоэффициент чувствительности,Линейныйиммобилизующей смеси, %мкА∙М-1∙см-2диапазон, М0.220 ± 20.05 - 10.315 ± 30.05 – 0.5нет отклика>0.5Наилучшими аналитическими характеристиками обладал биосенсор ссодержанием ПФС в смеси для иммобилизации - 0.2 об.% ПФС (рис.55).j, мкАсм-216в день приготовленияспустя 5 дней128400.20.40.60.81.0Слактата, МРис.
55. Градуировочные графики для определения лактата с помощью биосенсорапри тестировании в день приготовления и спустя 5 дней хранения (смесь для115иммобилизации фермента содержала 0.2% ПФС). Буферный раствор 0.1 M KCl,0.05 M KH2PO4 (рН 6.0), потенциал 0.00 В (n = 3, P = 0.95).Следует заметить, что полученный датчик стабильно работает даже спустя 5дней хранения при +4ºС и лишь незначительно теряет в чувствительности с 20мкА∙М-1∙см-2 до 17 мкА∙М-1∙см-2, что наглядно показано на рис. 55, так как тангенсугла наклона градуировочной зависимости свидетельствует о коэффициентечувствительности биосенсора. Тем не менее, чувствительность биосенсора оченьнизкая, а диапазон определяемых концентраций лактата составляет меньше двухпорядков и настолько сдвинут в область высоких значений, что нижний пределопределяемых содержаний становится чрезмерно высоким для определенияаналита в поте.При высоких содержаниях ПФС в смеси (более 0.3%) в системе ПИАотклика не наблюдалось.
Также проводили определение лактата в batch-режиме вдиапазоне концентраций: 1.10-6 – 1.10-1 М в буферном растворе, но никакогосигнала не было обнаружено. Это подтверждает блокирование активного центрафермента отрицательно заряженными сульфо-заместителями молекулы ПФС.Такимобразом,иммобилизацииЛОДприиспользованиипроисходитнизкихзначительноесодержанийухудшениеПФСдляаналитическиххарактеристик биосенсора, что объясняется экранированием активного центрафермента.Чувствительностьбиосенсоразначительнопадает,адиапазонопределяемых концентраций лактата сдвигается в область высоких значений,однако нижний предел определяемых содержаний становится чрезмерно высокимдля определения аналита в поте.
Поэтому, для достижения требуемого диапазонаопределяемых концентраций целесообразно было иммобилизовать фермент всмешанные мембраны силоксана и ПФС.8.3.Скрининг различных составов ферментсодержащих мембран сиспользованием сканирующей электрохимической микроскопииДля выявления закономерностей по изменению ферментативной активностиЛОД при использовании силоксановых, ПФС и смешанных мембран былаиспользована сканирующая электрохимическая микроскопия.
Для этого на единойподложке из ПЭТФ с графитовой пастой были нанесены три ферментсодержащие116мембраны с использованием смесей для иммобилизации, содержащих: 1.5%силоксана, 1.5% силоксана с 0.75% ПФС и 0.75% ПФС. Мембрана из смеси 1.5%ного силоксана была выбрана как обладающая наивысшей чувствительностью (§7). Объем пробы каждого состава - 0.1 мкл, измерения проводились в растворе 5мМ лактата в буферном растворе.Приведение зонда в контакт с поверхностью осуществлялось на основаниикривой приближения в растворе лактата в буферном растворе. Концентрация 5 мМлактата была выбрана для усиления контраста на получаемом изображении междуобластями, где пероксид генерировался ферментом, и областью, где пероксидпоявлялся в результате диффузии. В режиме обратной связи зонд изначальнонаходился на некотором расстоянии от исследуемой поверхности, где через негопротекал фоновый ток, обусловленный фоновым электролитом и лимитированныйполусферической диффузией электроактивных частиц к рабочей поверхностимикроэлектрода.
Зонт позиционировался таким образом, чтобы при касанииподложки он находился у края ферментсодержащей капли, а сканирование по осиХ проходило по еѐ центру.0.0I, нА-0.2-0.4-0.60300600900z, мкмРис. 56. Кривая приближения зонда в растворе 5 мМ лактата в буферном растворе(рН 6.0). По оси абсцисс отложено расстояние, пройденное зондом, по оси ординат– ток, скорость 1 мкм/с, шаг 0.5 мкм, потенциал 0.00 В.По мере приближения к поверхности диффузия всѐ больше затруднялась инаблюдалось постепенное увеличение катодного тока от 600 до 850 мкм по оси Z117(рис.
56). После чего на кривой наблюдается точка перегиба, соответствующаярасстоянию, на котором зонд коснулся поверхности. Далее зонд начинаетизгибаться, что обусловливает уменьшение катодного тока.Послеприведениязондавконтактсподложкой,содержащейиммобилизованную ЛОД, микроэлектрод опускали ниже на величину hР = -100мкм, достигая изгиба на некоторый угол для более уверенного контакта сисследуемой подложкой. Далее проводили линейное сканирование пробы по оси Х,проходя зондом вдоль капель.При сканировании по оси Х отчетливо наблюдается увеличение катодноготока при прохождении вдоль капель ЛОД (рис.
57). В районе 0 - 4000 мкм по оси Хвиден сигнал от фермента с использованием смеси 1.5% силоксана, далее от 4000до 6000 мкм сигнал от ЛОД, иммобилизованной в смешанную силоксан-ПФСмембрану, однако на месте нахождения фермента в мембране из ПФС (в районе6000 - 8000 мкм), наблюдается падение катодного тока до фонового значения. Этообусловливается блокированием фермента отрицательно заряженным ПФС, чтопредотвращает сигнал. Данное явление подтверждает результаты, полученные притестировании лактатных биосенсоров, которые были описаны в предыдущей главе(§ 8.2).-0.6I, нА-0.9-1.2-1.5-8000-6000-4000-20000x, мкмРис. 57.
Линейное сканирование трех ферментсодержащих мембран в растворе 5мМ лактата в буферном растворе; скорость 50 мкм/с, шаг 50 мкм, hР = -100 мкм,118потенциал 0.00 В. Смесь для иммобилизации фермента содержала (слева направо):0.75% ПФС, 1.5% силоксана и 0.75% ПФС, 1.5% силоксана.Подложка с иммобилизованными каплями ЛОД находилась в растворе 5 мМлактата в буферном растворе (рН 6.0) для последующего сканированияэлектрохимической активности поверхности в режиме коллекции-генерации. Былавыбрана область размером 9.0х1.2 мм, установленный рабочий потенциал 0.00 В,скорость линейного сканирования 50 мкм/с, шаг по оси Х 50 мкм, расстояниемежду областями линейного сканирования было установлено в 50 мкм, чтосоответствует приблизительной ширине электрода.y, мкмx, мкмI, нАРис.58.СЭХМ-изображениеучасткаподложкисферментсодержащимимембранами в растворе лактата в буферном растворе.
Скорость 50 мкм/с, шаг по Х50 мкм, шаг по Y 50 мкм, hР = -100 мкм, потенциал 0.00 В. Смесь дляиммобилизации фермента содержала (слева направо): 0.75% ПФС, 1.5% силоксанаи 0.75% ПФС, 1.5% силоксана.Темно-синяя окраска на рис. 58 соответствует высоким значениям катодныхтоков. Справа, на месте нанесения силоксановой ферментсодержащей мембраны,наблюдается высокая ферментативная активность ЛОД. В середине виден сигналот фермента, иммобилизованного в смешанную силоксан-ПФС мембрану, заметнаокраска капли в голубой цвет, что соответствует промежуточным значениям токови говорит о значительном понижении ферментативной активности. Однако наместе капли ЛОД в мембране ПФС наблюдается красная область, соответствующаянулевым значениям токов.
Отсутствие сигнала от фермента, иммобилизованного в119смесь 0.75% ПФС, подтверждает факт блокирования ЛОД отрицательнозаряженными сульфогруппами полимера.Таким образом, при использовании смешанных силоксан-ПФС мембран дляиммобилизации ЛОД происходит понижение сродства фермента к субстрату, какследствие наблюдается падение ферментативной активности, а вместе с тем иизменение аналитических характеристик лактатных биосенсоров на основе данныхсмесей и, предположительно, сдвиг диапазона определяемых концентраций вобласть высоких значений.8.4.Линейные сканирования двух ферментсодержащих мембран врастворах лактатаДляподтверждениягипотезыосдвигедиапазонаопределяемыхконцентраций лактата в область высоких значений при использовании смешанныхсилоксан-ПФС мембран были проведены линейные СЭХМ-сканирования пробЛОД в растворах лактата.
На единой подложке из ПЭТФ с графитовой пастой былинанесены две ферментсодержащие мембраны: силоксановая (1.5% силоксана всмеси) и смешанная (1.5% силоксана и 0.75% ПФС в смеси). Сначала проводилилинейное сканирование проб в растворе 0.5 мМ лактата в буферном растворе (рН6.0), далее раствор аккуратно сливали, чтобы не произошло смещение зонда иповторяли сканирование в растворе 5 мМ, а после чего в 50 мМ лактата.Результаты трех совмещенных линейных сканирований приведены на рис.
59.Как отчетливо видно на рис. 59, увеличение концентрации лактата в системене дает существенного увеличения сигнала при иммобилизации фермента всилоксановуюмембрану.Полученныйрезультатподтверждаетсяраннимиисследованиями (§ 7), так как диапазон определяемых концентраций лактата притестировании биосенсоров с силоксановыми мембранами составляет 1·10-6 - 5·10-3М и, дальнейшее увеличение концентрации лактата не дает увеличения сигнала.Однако при иммобилизации фермента в смешанную мембрану наблюдаетсявозрастание отклика при увеличении концентрации лактата в системе, что говорито том, что при использовании данной смеси для иммобилизации фермента приразработке биосенсора будет происходить расширение диапазона определяемыхконцентраций в область высоких значений.1200.0I, нА-0.20.5 мМ5 мМ50 мМ-0.4-0.6-0.8-1.0-8000-6000-4000-20000x, мкмРис.
59. Линейные сканирования двух ферментсодержащих мембран в растворах0.5, 5 и 50 М лактата в буферном растворе; скорость 50 мкм/с, шаг 50 мкм, hР = -60мкм, потенциал 0.00 В.Смесь для иммобилизации ЛОД содержала: слева - 1.5%силоксана и 0.75% ПФС, справа - 1.5% силоксана.Таким образом, иммобилизация лактатоксидазы в смешанные мембранысилоксан-ПФС может использоваться с целью смещения диапазона определяемыхконцентраций лактата в область высоких значений при создании биосенсоров.8.5.Сканирование четырех проб лактатоксидазы в смешанныхмембранах методом сканирующей электрохимической микроскопииДля изучения ферментативной активности ЛОД при иммобилизации в смесисилоксан-ПФС, мембраны были нанесены на единую подложку из ПЭТФ сграфитовойпастойэлектрохимическомдляпроведениямикроскопе.экспериментаИспользуемыесмесинадлясканирующемиммобилизациифермента содержали: 0.4% силоксана и 0.2% ПФС, 1% силоксана и 0.5% ПФС, 1%силоксана и 1% ПФС и последняя: 0.4% силоксана и 0.6% ПФС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
