Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 16
Текст из файла (страница 16)
УравнениеМихаэлиса-Мэнтен.Зависимость скорости ферментативной реакции от начальной концентрациисубстрата представляет собой фрагмент ветви гиперболы. Зависимость [S]0 от V99может быть использована для определения концентрации субстрата методомградуировочного графика. Таким образом, кажущаяся константа Михаэлиса Kмможет использоваться для оценки верхней границы диапазона определяемыхконцентраций.ОтношениеVм(каж.)кKм(каж)характеризуеткоэффициентчувствительности отдельного биосенсора в условиях эксперимента.
С точностьюдо концентрации фермента отношение Vм (каж.)/Kм (каж.) равно константеспецифичности, мере частоты и эффективности образования фермент-субстратногокомплекса.На рис. 43 показана зависимость Км (здесь и везде далее рассматриваетсякажущаяся константа Михаэлиса) от содержания силоксана в смеси дляиммобилизации фермента. На графике видно увеличение сродства фермента ксубстрату при увеличении концентрации силоксана в смеси для иммобилизациифермента от 0.1 до 1.5 %, наблюдается оптимум в диапазоне 1.3 – 2.2 % силоксана,а дальнейшее увеличение содержания силоксана в смеси ведет к понижениюаффинности фермента к субстрату.0.8KМ, мМ0.60.40.20.00.51.01.52.02.53.0NH2Sil, %Рис. 43.
Зависимость кажущейся константы Михаэлиса от содержания силоксана виммобилизующей смеси для фермента (n = 10, P = 0.95).100Стоит отметить, что увеличение плотности мембраны создает диффузионныезатруднения для субстрата и, тем самым, понижает аффинность фермента ксубстрату. Но в данном случае сродство фермента к субстрату возрастает приувеличении концентрации (от 0.1 до 1.5% силоксана в смеси), что говорит осоздании наиболее благоприятной среды для фермента. Дальнейшее понижениесродства при увеличении содержания силоксана в мембране можно объяснитьпредположительно чрезмерным уплотнением мембраны и, таким образом,частичным блокированием фермента.
Для подтверждения данного предположениябыло необходимо определить плотности ферментсодержащих мембран, чтоописано в следующей главе.Таким образом, можно сделать вывод, что данные, показанные с помощьюСЭХМ, полностью согласуются с результатами, полученными при тестированиипланарных биосенсоров на лактат. Найдено оптимальное содержание силоксана всмеси для иммобилизации фермента для создания высокоэффективного биосенсорадля определения лактата.7.5.Использование методов сканирующей электронной и лазерноймикроскопии и профилометра для исследования ферментсодержащихмембранДля изучения структуры ферментсодержащих мембран, их шероховатости итекстуры поверхности была использована сканирующая электронная микроскопия,а также для расчета плотностей была применена сканирующая лазернаямикроскопия и профилометрия.При первоначальном рассмотрении мембраны были исследованы наподложке из ПЭТФ с нанесенной графитовой пастой методом СЛМ, но результатыне увенчались успехом по причине того, что графитовая паста при близкомрассмотрении рельефная, как видно на рис.
44, и мембрана, вероятно, оседает внеровностях поверхности.Для решения этой проблемы мембраны были рассмотрены на подложке изПЭТФ при использовании шкалы приближений на 100 и 10 мкм (рис. 45 и 46).101Рис.44.Трехмерноеизображениеповерхностиполиэтилентерефталатаснанесенной графитовой пастой с использованием сканирующего лазерногомикроскопа.Рис.
45. Изображения ферментсодержащих мембран различной плотности спомощью сканирующего лазерного микроскопа; a) подложка из ПЭТФ и три102ферментсодержащие капли с содержанием силоксана в смеси для иммобилизации:b) 0.3%, c) 1.5% и d) 2.8%. Шкала 100 мкм.Рис. 46. Изображения ферментсодержащих мембран различной плотности спомощью сканирующего лазерного микроскопа; a) подложка из ПЭТФ и триферментсодержащие капли с содержанием силоксана в смеси для иммобилизации:b) 0.3%, c) 1.5% и d) 2.8%.
Шкала 10 мкм.Также мембраны были исследованы методом сканирующей электронноймикроскопии на подложке ПЭТФ с нанесенной на нее графитовой пастой, что вточностивоспроизводитповерхностьрабочегоэлектродапланарнойтрехэлектродной структуры. Была использована шкала приближений на 20 и 5 мкм(рис. 47 и 48).На рис. 47 и 48 видно, что поверхность рабочего электрода планарногобиосенсора рельефная, мембрана заполняет собой микроскопические неровности иоседает сверху островками.103Рис.
47. Изображения ферментсодержащих мембран различной плотности спомощью сканирующего электронного микроскопа; a) подложка из ПЭТФ и триферментсодержащие капли с содержанием силоксана в смеси для иммобилизации:b) 0.3%, c) 1.5% и d) 2.8% силоксана. Шкала 20 мкм.Рис. 48. Изображения ферментсодержащих мембран различной плотности спомощью сканирующего электронного микроскопа; a) подложка из ПЭТФ и три104ферментсодержащие капли с содержанием силоксана в смеси для иммобилизации:b) 0.3%, c) 1.5% и d) 2.8% силоксана. Шкала 5 мкм.На рис. 44 – 48 отчетливо наблюдается изменение структуры и пористостимембран при иммобилизации фермента в смеси с различными содержаниямисилоксана.
При сильном увеличении заметно, что все мембраны обладаютиндивидуальной структурой: при использовании 0.3% силоксана она схожа сигольчатой структурой, при применении 1.5 и 2.8% мембраны представляют собойпористую массу, 1.5 – с крупными, а 2.8 – с мелкими порами. Для подтвержденияпредположения об увеличении плотности мембраны при иммобилизации ферментав более концентрированные растворы силоксана были рассмотрены высоты иплощади мембран с помощью профилометра и СЛМ для дальнейшего расчетаплотностей. Полученные данные приведены в табл.
5.Таблица 5. Высоты и площади ферментсодержащих силоксановых мембран,полученные с помощью профилометра и сканирующего лазерного микроскопа.Исследуемый объем пробы составлял 0.1 мклСодержание силоксана в смесидля иммобилизации, %Средняя высота мембраны, мкмПлощадь мембраны, мм20.31.52.81.75.09.0119418081661Из данных табл. 5 было рассчитано увеличение плотностей мембранотносительно 0.3%-ного содержания силоксана в смеси для иммобилизации.Мембраны, с содержанием силоксана 1.5 % в смеси демонтрируют увеличениеплотности относительно 0.3 % в 1.1 раза, а 2.8 % силоксана – в 1.3 раза. Из чегоможно сделать вывод, что, как и предполагалось, плотности ферментсодержащихсилоксановых мембран возрастают с увеличением концентрации силоксана виммобилизующей смеси.Как было описано в предыдущей главе, при увеличении плотностиферментсодержащей мембраны сродство лактатоксидазы к субстрату обычнопадает, что объясняется диффузионными затруднениями между ферментом исубстратом.
Однако в нашем случае наблюдается обратная картина - сродствофермента к субстрату возрастает при увеличении плотности мембраны (от 0.1 до1051.5 % силоксана в смеси), а минимум значения Км приходится на 1.3 – 2.2 %силоксана, что говорит о создании максимально благоприятной среды дляфермента (рис. 43). Из чего можно сделать вывод, что именно в такой мембранелактатоксидаза будет демонстрировать наивысшую активность и стабильность.Таким образом, с помощью методов сканирующей лазерной микроскопии ипрофилометрии было выявлено, что плотности ферментсодержащих мембранвозрастают с увеличением концентрации силоксана в иммобилизующей смеси,наилучшее сродство фермента к субстрату наблюдается при использовании 1.3 –2.2 % силоксана. Это говорит о создании наиболее благоприятной среды длялактатоксидазы и указывает на перспективу создания высокочувствительного ивысокостабильного биосенсора для определения лактата.7.6.Аналитические характеристики высокочувствительногобиосенсора для определения лактатаНаилучшейвоспроизводимостью,а вместе с тем имаксимальнойчувствительностью, наиболее широким диапазоном определяемых концентрацийлактата и высокой стабильностью характеризовался биосенсор с использованиемсмеси для иммобилизации лактатоксидазы, содержащей 1.5% силоксана.На рис.
49 представлен отклик биосенсора для определения лактата в batchрежиме, видны маленькие значения фоновых токов, первая определяемаяконцентрация четко различима. Видна стабильность оклика, также можноотметить, что значения тока не уменьшаются, а даже немного растут со временем.Биосенсортестировалисиспользованиеммодельныхрастворовлактататрехкратно, на основании чего строили градуировочную зависимость (рис. 50).Диапазон определяемых концентраций лактата составляет более чем 3 порядка с1·10-6 до 5·10-3 М, предел обнаружения – 0.9∙10-6 М лактата.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
