Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Ростовой раствор содержал 4 мМ K3[Fe(CN)6] и 4 мМ FeCl3 вфоновом электролите 0.1 M KCl, 0.1 M HCl. Электроосаждение БЛ проводили втрехэлектродной системе в потенциодинамическом режиме, при разверткепотенциала, подаваемого на рабочий электрод в диапазоне от 0.40 до 0.75 В прискорости развертки потенциала 20 мВ/с в течение 5 - 7 циклов. В качествевспомогательного электрода использовалась платиновая проволока, в качествеэлектрода сравнения - истинный хлоридсеребряный электрод, находящийся в 1 МKCl и отделенный от ростового раствора керамической мембраной. Послеосаждения микроэлектрод удаляли из ростового раствора и тщательно промываливодой.Микроэлектроды, модифицированные покрытиями берлинской лазури,подвергали потенциодинамической обработке в диапазоне потенциалов от -0.05 до0.35 В в фоновом электролите 0.1 M KCl, 0.1 M HCl при скорости разверткипотенциала 40 мВ/с в течение 18 циклов с целью насыщения катионами калия.После чего микроэлектроды ожигали при 100С в течение часа и охлаждали докомнатнойтемпературы.
Сенсорынаблюдалисьследующиесчитались надлежащего качества,аналитическиехарактеристики:есликоэффициентчувствительности не менее 0.5 А∙М-1∙см-2, линейный диапазон определяемыхконцентраций H2O2 не менее 2 порядков, операционная стабильность не менее 120мин.646.3.4.Спектрофотометрическое определение концентрациипероксида водородаКонцентрацию пероксида водорода в коммерческом препарате определялиспектрофотометрически: разбавляли коммерческий раствор (в 2·102 – 1 ·104 раз) вдистиллированной воде, затем полученный раствор пероксида водорода помещалив кварцевую кювету. Измеряя оптическую плотность растворов H2O2 при длиневолны 230 нм, рассчитывали концентрацию пероксида водорода в образцах((H2O2) = 72.7 М-1·см-1, l = 1 см).6.3.5.Измерение активности лактатоксидазы в водно-органических смесях по скорости окисления лактатаСкорость окисления лактата под действием лактатоксидазы (общейактивностиЛОД)измерялиприпомощипланарногоэлектрода,модифицированного БЛ в ячейке на 250 мкл в batch-режиме при 25ºС.
А именно,регистрировалиизменениетока,пропорциональноескоростинакопленияпероксида водорода в системе в ходе химической реакции, катализируемойферментом.Для измерения общей активности растворенного в воде фермента ячейкузаполняли фосфатным буферным раствором, содержащим ЛОД (1 мг/мл) и прирабочемпотенциале0.00Випостоянномперемешиванииследилизаустановлением фонового тока. После чего инжектировали раствор лактата натрия,до достижения концентрации его в растворе 1·10-5 М. Фиксировали скоростьнакопления пероксида водорода – тангенс угла наклона прямой. Далее подобныеизмерения проводили при концентрациях лактата: 5·10-5, 1·10-4, 5·10-4, 1·10-3 и 5·103М, для каждой концентрации аналитический сигнал рассчитывали по результатамтрех измерений.Общуюактивностьферментаопределяликакскоростьнакопленияпероксида водорода в ходе реакции (мМмин-1). Удельную активность фермента врастворе определяли как количество мкмолей пероксида водорода, накопленного вприсутствии 1 мг фермента в течение 1 мин.65Удельная активность фермента равняется его массе (в мг), которая способнапревратить 1 мкмоль субстрата за 1 мин в стандартных условиях и выражается в[мкмоль/мин/мг].6.3.6.Определение концентрации лактата с использованиемэлектрода КларкаИзмерение концентрации лактата осуществляли при помощи кислородногоэлектрода Кларка при 25ºС: приэтом регистрировалиизменениетока,пропорциональное скорости убывания кислорода в системе в ходе химическойреакции, катализируемой ферментом.Ячейку со встроенным электродом Кларка заполняли раствором лактата,приготовленным с использованием буферного раствора (рН 6.0).
Для этогокоммерческий препарат лактата последовательно разбавляли в 3·105 - 3·106 раз.При рабочем потенциале -0.60 В и постоянном перемешивании следили заустановлением базового (фонового) тока восстановления кислорода. Величина токавосстановлениякислородапропорциональнарастворимостимолекулярногокислорода в буферном растворе при температуре 25ºС, т.е.
2.5·10-4 М. Послевыхода на стационарный уровень инжектировали водный раствор фермента, доконечной концентрации в ячейке 1 мг/мл.Концентрацию лактата определяли как количество израсходованного вреакциикислорода,дляэтогорассчитывалиинтегралнаоснованииэкспериментальной кривой.6.3.7.Иммобилизация лактатоксидазы в мембранусилоксанаИммобилизация лактатоксидазы в мембрану γ-аминопропилтриэтоксисиланапроводилась по методике, разработанной ранее [89, 198].
Методика включала всебя следующие стадии:1) разбавление коммерческого препарата силоксана абсолютированнымизопропиловым спиртом;2) разбавление фермента ЛОД дистиллированной водой до концентрации10 мг/мл;663) смешивание водного раствора фермента со спиртовым растворомсилоксана (до достижения концентрации фермента 1 мг/мл, асодержания силоксана от 0.1 до 5.0 об.%);4) нанесение аликвоты 2 мкл ферментсодержащей смеси на рабочуюповерхность электрода, модифицированного БЛ;5) высушивание при +4ºС 45 мин.Иммобилизация лактатоксидазы в мембрану6.3.8.перфторсульфонированного полимераИммобилизация лактатоксидазы в мембрану перфторсульфонированногополимера (ПФС - аналога нафиона), проводили по методике, описанной выше напримере силоксана, с тем лишь различием, что на первом этапе спиртовой растворПФС нейтрализовали 25%-ным раствором аммиака для достижения величины рНраствора полиэлектролита 6.0.Концентрацияферментавфермент-полиэлектролитномкомплексесоставляла 1 мг/мл, содержание воды в мембране - 10 %, ПФС 0.1 – 1.0 об.%.Иммобилизация лактатоксидазы в смешанную6.3.9.мембрану силоксан – перфторсульфонированный полимерДля иммобилизации лактатоксидазы была опробована схема иммобилизациифермента в мембрану силоксан и ПФС из органического растворителя, котораяописана выше.Концентрациясоставляла1ферментамг/мл,всодержаниефермент-полиэлектролитномводывмембране-комплексе%,10γ-аминопропилтриэтоксисилана 0.01 – 5.00 об.%, ПФС 0.10 – 8.50 об.%.6.3.10.
Проточно-инжекционное определение лактатаПередначаломизмеренийчерезячейку,содержащуюэлектрод,модифицированный берлинской лазурью с иммобилизованной лактатоксидазой,пропускали буферный раствор до полного установления базового тока.Для построения градуировочного графика электрода опряделяли лактатнатрия в проточно-инжекционном режиме. Для этого проводили инжектирование50 мкл модельного раствора лактата (1·10-6 – 5·10-1 М) в буферном растворе (рН676.0). Среднюю величину отклика электрода на лактат вычисляли по результатам 3единичных измерений. О величине отклика судили по величине тока пика,прописываемого на мониторе компьютера сразу после инжектирования, приподсчетах также учитывали величину базового тока.
Время единичного измеренияотклика электрода составляло не более 2 мин. По значениям средних величиноткликов строили градуировочный график.В зависимости от состава иммобилизующей смеси для фермента, модельныеконцентрации лактата составляли: 1.10-6 – 5.10-3 М, либо 5.10-5 – 1 М.6.3.11. Определение лактата в batch-режимеВ ячейку, ѐмкостью 250 мкл, заполненную буферным раствором (рН 6.0),помещали планарный электрод, модифицированный БЛ с иммобилизованной ЛОД.Измерения проводили при постоянном перемешивании. В течение 5 - 7 минрегистрировали значение базового тока до выхода его на постоянный уровень.Далее в систему инжектировали лактат, чтобы концентрация в ячейке составляла1·10-6 М, наблюдали ступеньку.
Затем, после выхода на стационарный уровень,вводили лактат в таком количестве, чтобы концентрация достигала 5·10-6 М и такдалее до конечной концентрации 5·10-3 М. О величине отклика судили по значениютоканавводимуюконцентрациюлактата.Экспериментвоспроизводилитрехкратно, на основании чего строили градуировочный график.В зависимости от состава иммобилизующей смеси для фермента, модельныеконцентрации лактата составляли: 1·10-6 – 5·10-3 М, либо 5·10-5 – 1·10-1 М.6.3.12.
Определение пероксида водорода в batch-режиме спомощью микроэлектрода, модифицированного берлинскойлазурьюВ стакан, ѐмкостью 5 мл, заполненный буферным раствором, помещалигибкийпланарныймикроэлектрод,модифицированныйБЛ.Вкачествевспомогательного электрода использовалась платиновая проволока, в качествеэлектрода сравнения использовался истинный хлоридсеребряный электрод,находящийся в 1 М KCl. Измерения проводили при постоянном перемешивании.
Втечение 5 - 7 мин фиксировали значение базового тока до выхода его напостоянный уровень. Далее в стакан инжектировали пероксид водорода, чтобы68концентрация в ячейке составляла 1·10-5 М, наблюдали ступеньку. Затем, послевыхода на стационарный уровень, вводили H2O2 в таком количестве, чтобыконцентрация достигала 5·10-5 М и так далее до конечной концентрации 1·10-2 М.О величине отклика судили по высоте тока ступеньки на вводимую концентрациюпероксида водорода.
Эксперимент воспроизводили трехкратно, на основании чегостроили градуировочный график.6.3.13. Изучение стабильности сенсоров и биосенсоровОперационную стабильность сенсора в batch-режиме определяли какизменение амперометрического отклика в ячейке или стакане на нахождениеэлектрода в неизменной концентрации аналита при постоянном перемешивании.Стабильность = in/i1.100%, где in – величина отклика на n-ое измерение, i1 –величина начального отклика.Стабильность сенсора при хранении определяли в ходе его тестирования попрошествии определенного времени хранения в холодильнике при температуре+4ºС. Тестировали биосенсор в модельных растворах лактата в периодическомрежиме, о стабильности сенсора судили по величине чувствительности.6.3.14.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
