Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Стоит отметить, что концентрациялактата в поте может варьироваться в зависимости от скорости потоотделения итипа жидкости. В настоящей работе рассматривались основная и стимулированнаяпотовая жидкость, контроль скорости потоотделения не производился.Эксперимент начинали с выхода на стационарный уровень, для чего намонитор в область конусообразного отверстия наносили несколько капельбуферного раствора (рН 6.0), которые самопроизвольно заполняли капилляр, иждали выхода на фон, далее монитор прикладывали к месту выделения пота ификсировали с помощью эластичного жгута. Наблюдался всплеск тока идальнейший выход на стационарный уровень, соответствующий содержаниюлактата в поте, с течением времени уровень сигнала изменялся в большую илименьшую сторону, при уменьшении потока жидкости в капилляре сигнал спадал кминимуму.Также с помощью монитора регистрировали динамику накопления лактата, втаком случае сухую ячейку прикладывали к месту выделения пота, откликбиосенсора на примере этой системы представлен на рис.
80. Первые несколькосекунд наблюдались нулевые значения токов, что объясняется отсутствиемраствора в системе. Далее неивазивный монитор фиксировали на ноге (на заранееактивированном месте), при заполнении капилляра потом наблюдается смачиваниеи поляризация электрода, что объясняет всплеск тока. Менее, чем за минутусистема приходит к равновесию и наблюдается выход на стационарный уровень, втечение следующих 180 с наблюдаются значения токов, соответствующиесодержанию лактата в поте в состоянии покоя. Далее, в районе 300 – 500 снаблюдаются значения токов, соответствующие содержанию лактата в поте вусловиях небольшой физической активности.144в отсутствии раствора0.0в состоянии покояв процессе физической нагрузкиI, мкА-0.2-0.4-0.60100200300400время, сРис.
80. Отклик биосенсора при определении лактата в поте в системенеинвазивного монитора (смесь для иммобилизации ЛОД содержала 3% силоксанаи 5% ПФС).В неинвазивном мониторе предусмотрен капилляр для выведения жидкостииз системы (рис. 77), посредством которого пот собирали в пробирку Эппендорфаи, в дальнейшем, использовали для анализа альтернативным методом в системепроточно-инжекционного анализа с разбавлением образца в 100 раз. В качествеальтернативного метода выступал полуавтоматический проточно-инжекционныйанализатор на лактат, прошедший испытание на определение лактата в крови идругихбиологическихжидкостяхссертифицированнымавтоматическиманализатором HumaStar 300 (R > 0.99).Результаты по содержанию лактата в поте, полученные с помощьюнеинвазивного монитора состояния гипоксии и с использованием альтернативногометода,представленывтабл.продемонстрирована на рис. 81.10,корреляциярезультатовнаглядно145Таблица 10.
Концентрации лактата в поте в состоянии покоя и при физическойнагрузке,полученныесиспользованиемнеинвазивногомонитораиальтернативного метода (n = 3, P = 0.95)СостояниеДоброволецС(лактата), мМС(лактата), мМнеинвазивный мониторальтернативный методВ состоянии 110 ± 516 ± 2покоя212 ± 414 ± 1313 ± 417 ± 248±412 ± 2процессе 118 ± 422 ± 3Вфизической246 ± 853 ± 4нагрузки349 ± 855 ± 4435 ± 846 ± 3альтернативный методСлактата, мМ50403020100102030Слактата, мМ4050неинвазивный мониторРис. 81.
Корреляция по содержанию лактата в поте, измеренному с помощьюнеинвазивного монитора непосредственно с мышцы руки/ноги и с использованиемальтернативного метода в системе ПИА с разбавлением образца в 100 раз, R =0.9930.146Как видно на рис. 81, наблюдается высокая корреляция результатов,полученныхприпомощинеинвазивногомонитораисиспользованиемальтернативного метода, R=0.9930. Также на графике можно заметить два облакаданных, соответствующие содержанию лактата в поте в состоянии покоя и прифизической нагрузке, результаты полностью согласуется с литературнымиданными [11, 84-87].Таким образом, создан неинвазивный монитор состояния гипоксии,проводящий непрерывное определение лактата в поте в состоянии покоя и прифизической нагрузке.
Показана высокая корреляция результатов по содержаниюлактата в поте, полученных с использованием монитора и при помощиальтернативного метода. Создание монитора состояния гипоксии открываетобширные перспективы развития неинвазивной диагностики, в том числе в областиспортивной медицины.147ВЫВОДЫ1.
Метод сканирующей электрохимической микроскопии адаптирован дляскринингаферментсодержащихмембран.Дляэтогоразработанвысокостабильный микросенсор для определения пероксида водорода на основемикроэлектрода, модифицированного берлинской лазурью и применен вкачестве зонда электрохимического микроскопа. Таким образом, определеноптимальныйсоставсмесидляиммобилизациилактатоксидазы,обеспечивающий наивысшую активность и стабильность включенного вмембрану фермента.2.
Создан высокочувствительный и высокостабильный биосенсор для определениялактата на основе планарных электродов, модифицированных берлинскойлазурью, и фермента лактатоксидазы, иммобилизованной в мембрану γаминопропилсилоксана.Диапазонопределяемыхконцентрацийлактатасоставляет 1·10-6 - 5·10-3 М, коэффициент чувствительности достигает 0.33А·М-1·см-2.Чувствительностьбиосенсораповышаетсявчетырераза,операционная стабильность - в два раза по сравнению с лучшим лактатнымдатчиком. Биосенсор сохраняет 80% исходного значения коэффициентачувствительности при хранении при +4°С в течение 18 мес.3.
Предложен метод инженерии лактатоксидазы при иммобилизации. Длярасширения диапазона определяемых содержаний лактата в область высокихконцентраций, необходимых для анализа неразбавленного пота, предложеноиспользовать отрицательно заряженный перфторсульфонированный полимер(аналог нафиона) в качестве компонента мембраны. За счет экранированиясубстрат-связывающего участка фермента полимером достигается понижениесродства лактатоксидазы к субстрату. Это иллюстрируется повышениемкажущейся константы Михаэлиса в 30 раз по сравнению с константой,наблюдаемой в случае электронейтральных силоксановых мембран.4. Разработанлактатныйбиосенсор,работающийвобластивысоких(миллимолярных) концентраций лактата при иммобилизации фермента всмешанныемембраныизγ-аминопропилсилоксанаиперфторсульфонированного полимера.
Диапазон определяемых концентраций148лактата сдвигается в область высоких значений на два порядка и составляет впериодическом режиме 0.1 – 80 мМ. После трех часов непрерывных измеренийсигнал биосенсора остается на первоначальном уровне, а при хранении втечение 3 мес при +4ºС обеспечивается исходное значение чувствительности.5. Путем интеграции биосенсора на высокие концентрации и потосборника созданнеинвазивныймониторсостояниягипоксии,работающийнаосновенепрерывного мониторинга лактата в поте. Достоверность результатов посодержанию лактата в поте как в состоянии покоя, так и в процессе физическойнагрузки, полученных при апробации монитора, подтверждена с помощьюальтернативного метода, коэффициент корреляции составил 0.9930.149СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ1.
Dringen R., Gebhardt R., Hamprecht B. Glycogen in astrocytes - possible function aslactate supply for neighboring cells // Brain Res. 1993. T. 623, № 2. C. 208-214.2. Lee J. A., Tsai Y. C., Chen H. Y., Wang C. C., Chen S. M., Fukushima T., Imai K.Fluorimetric determination of D-lactate in urine of normal and diabetic rats by columnswitching high-performance liquid chromatography // Anal. Chim. Acta. 2005. T.
534, №2. C. 185-191.3. Smutok O., Gayda G., Gonchar M., Schuhmann W. A novel L-lactate-selectivebiosensor based on flavocytochrome b(2) from methylotrophic yeast Hansenulapolymorpha // Biosens. Bioelectron. 2005. T. 20, № 7. C. 1285-1290.4. Lamb G. D., Stephenson D. G. Point: Counterpoint: Lactic acid accumulation is anadvantage/disadvantage during muscle activity // J. Appl. Phys. 2006. T. 100, № 4.
C.1410-1412.5. Фэйхи Т. Так ли страшна молочная кислота? // Musc. Develop. 2000. T. 2. C. 1-5.6. Goodwin M. L., Harris J. E., Hernández A., Gladden L. B. Blood lactate measurementsand analysis during exercise: a guide for clinicians // J. Diab. Sci Technol. 2007. T. 1, №4. C. 558-569.7. Brooks G. A. Anaerobic threshold: review of the concept and directions for futureresearch // Med.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
