Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 5

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Также стоит иметь ввиду, что на содержание лактата в24КВВ и слюне сильно влияет пища, которой питался человек и отбор пробыобязательно проводить натощак. Концентрация лактата в моче зависит от многихфакторов, поэтому не может коррелировать с содержанием его в крови.Содержание лактата в слезной жидкости изучалось и выдвигались гипотезы осуществующей корреляции [81, 82].В литературе имеются разногласия по поводу корреляции содержаниялактата в поте и крови, однако последние исследования в этом направлениипоказали, что существует корреляция по увеличению лактата в крови и поте [11,77, 83].

Измерения лактата в поте проводились с использованием биосенсоров наоснове планарных структур, модифицированных БЛ с иммобилизованной ЛОД вмембрану γ-аминопропилсилоксана (с разбавлением образца), определение лактатав крови с помощью автоматического анализатора C_Line (Biosen). Статистическиеданные не показали корреляции между абсолютным значениями концентрациилактатавпотеиввенознойикапиллярнойкрови.Однакоанализэкспериментальных данных показал, что увеличение концентрации лактата в потекоррелирует с ростом аналита в капиллярной (R2 = 0.7200, p<0.05) и венозной (R2 =0.8400, p<0.05) крови [11].Содержание лактата в поте в состоянии покоя по нескольким источникамсоставляет от 4 до 25 мМ [11, 84-87], однако при тяжелых физических нагрузкахэта концентрация достигает 40 – 80 мМ [11, 84, 86]. Более недавние статьи осоздании лактатных биосенсоров докладывали о 5 - 10 мМ как о самой высокойопределяемойконцентрациилактата[32,88-91].Дажетакназываемый«неинвазивный датчик для определения лактата в человеческом поте в процессереального времени» лимитируется только 20 мМ как самой высокой определяемойконцентрацией [92], чего недостаточно для мониторинга лактата в процессефизических нагрузок.

То есть, определение лактата в поте при физическихнагрузках можно проводить только путем разбавления образца в 100 и более раз,что не представляется возможным при разработке системы непрерывногомониторинга состояния гипоксии.Для сбора потовых проб без физической нагрузки известен способ активациипотовой железы путем электрофореза с пилокарпином, препарат вызывает резкоеусиление секреции слюнных и потовых желез. В литературе представлен и другой25способ активации потовых желез, с помощью которого метаболиты с поверхностикожи собираются в гидрогель и впоследствии извлекаются с помощьюаналитической установки с использованием электрораспылительной ионизации имасс-спектрометрометрии [93].

Как заявлено в статье, данный метод занимает 12мин, что сравнительно быстро, относительно элекрофореза с пилокарпином(порядка 30 мин). Но следует заметить, что для изъятия проб требуется сложноеаппаратное оснащение и сбор пота можно проводить только у аналитическойустановки, тогда как для проведения электрофореза требуется миниатюрныйприбор, легко переносящий транспортировку.Следует отметить, что концентрация биоаналитов в физиологическихжидкостях,выделяемыхнаружу,зависитоттипажидкости(основная,стимулированная, эмоциональная) и скорости ее выделения. Очевидно, что пристимуляциивыработкипотаконцентрациялактата,атакжескоростьпотоотделения может варьироваться, однако данный вопрос до конца не изучен.Таким образом, неинвазивный мониторинг лактата представляет большойинтерес, ранее была выявлена корреляция увеличения концентрации лактата вкрови и в поте, что представляет возможным сменить объект исследования с кровина пот.

Однако нет существующих аналогов, работающих в диапазонеконцентраций, покрывающем физиологическое содержание лактата в поте, именнопоэтому важной задачей является создание такого неинвазивного мониторасостояния гипоксии.26Глава 2. Электрохимические биосенсоры2.1.Принцип действия и классификация биосенсоровНаиболее яркими представителями аналитических систем, сочетающих всебевысокуючувствительностьиселективностьопределения,являютсябиосенсоры [94].

При этом электрохимические устройства традиционно имеютнаибольшее распространение среди существующих биосенсоров [95, 96]. Такиеустройства производят простую, недорогую и в то же время точную платформу длядиагностики пациентов. Электрохимический биосенсор включает в себя элементбиохимического распознавания и трансдьюсер. Цель трансдьюсера заключается впреобразовании биохимической информации в полезный электрический сигнал.Первое предположение о возможности иммобилизации ферментов наэлектрохимических датчиках было выдвинуто еще в 1962 году Лиландом Кларкоммладшим и соавторами [25]. Была вынесена гипотеза, что данные «ферментныеэлектроды» в последствии расширят диапазон аналитических возможностейбазового датчика.Основнымпреимуществомбиосенсоровотносительномножествасуществующих методов является высокая специфичность биоузнающего элемента,благодаря чему можно количественно определять индивидуальное анализируемоевещество или группу веществ в смеси огромного числа подобных соединений.

Этозначительно упрощает работу с кровью, потом и другими биологическимижидкостями.Биосенсоры классифицируются по типам биорецепторов и трансдьюсеров.Различные типы биологических структур используются в биосенсорах в качествеузнавающего элемента: [97]: Целые организмы Ткани Клетки Органеллы Мембраны Антитела27 Рецепторы Фермент Окислительно-восстановительные белки Нуклеиновые кислоты Органические молекулыМетоды биораспознавания с основными типами рецепторов приведены нарис. 1.субстратантителоанферментнуклеиновыекислотыклеткиРис.

1. Методы биораспознавания с различными типами биорецепторов.Используемые в биосенсорах преобразователи сигнала (трансдьюсеры)разделяются на [97]: Амперометрические Кондуктометрические Импедиметрические Калориметрические Оптические Акустические Механические ХимическиеВсе виды биоселективных элементов можно комбинировать с различнымитрансдьюсерами. В качестве биоузнающего элемента наибольшую популярностьприобрелиферментныеиклеточныебиосенсоры.Типытрансдьюсеров28определяются физико-химическими основами их действия и позволяют разделитьбиологические сенсоры на следующие основные категории: электрохимические,оптические и гравиметрические.

Среди оптических биосенсоров следует особовыделитьсенсоры,плазмонногооснованныерезонанса[98].нафизическомМетодприменимпринципедляповерхностногодетекцииаффинныхвзаимодействий, что использовано фирмой Biocore. Основным недостаткомтрансдьюсера является чувствительность к различным параметрам среды, в томчисле к локальному изменению температуры. Гравиметрические трансдьюсерыоснованы на принципе резонанса акустической волны, распространяющейся вдольповерхности кварцевого кристалла. По уравнению Соусбери существует линейнаязависимость резонансной частоты от изменения массы на поверхности кристалла.Однако резонансная частота также линейно зависима от «вискозоэластического»коэффициента который может варьироваться в широких пределах в присутствииполимеров, что может значительно искажать результаты экспериментов.Бесспорное преимущество принадлежит электрохимическим биосенсорам,они менее зависимы от эффектов окружающей среды, чем оптические, при этомустройства позволяют осуществлять перенос информации, преобразованной вэлектрический сигнал, непосредственно на персональный компьютер [94].Амперометрические и потенциометрического трансдьюсеры наиболее широкоиспользуютсяприсозданииэлектрохимическихбиосенсоров.Впотенциометрических устройствах аналитическая информация получается путемпреобразования процесса биораспознавания в сигнал потенциала с использованиемионселективных электродов (ИСЭ).

В амперометрических устройствах происходитизмерение тока при наложении постоянного потенциала. Амперометрическиебиосенсоры имеют большее распространение в связи с высокой чувствительностьюи широким линейным диапазоном определяемых концентраций, а также они прощеподвергаются миниатюризации, а обычное для них массовое производствообеспечивает низкую себестоимость.2.2.Амперометрические биосенсоры для определения лактатаСуть метода амперометрии заключается в измерении тока окисления иливосстановленияэлектроактивныхчастиц.Нарабочемэлектродезадаѐтся29постоянныйпотенциалотносительноэлектродасравнения,прикоторомпроисходит поляризация рабочего электрода.

Наблюдаемый ток пропорционаленобъѐмной концентрации электроактивных частиц, или скорости еѐ изменения вбиокаталитическом слое. Амперометрические устройства широко распространены,в качестве примера можно привести лактатный [50] и глюкозный [27] биосенсоры,обладающие на сегодняшний день наилучшими аналитическими характеристикамидля определения данных аналитов. Эти аналитические устройства основаны надействии ферментов, которые, в свою очередь, составляют 90% всех коммерческизначимых биосенсоров. В табл.

1 (§ 1.2) приведены сведения об аналитическиххарактеристиках различных амперометрических биосенсоров для определениялактата. Оксидазы катализируют окисление своего специфического субстратакислородом воздуха, при этом кислород восстанавливается до пероксида водорода.Принцип действия оксидазосодержащих биосенсоров основан на детекции либосубстрата ферментативной реакции – кислорода, либо продукта – пероксидаводорода. По данному принципу работают биосенсоры первого поколения, схемадействия данных устройств приведена на рис.

Характеристики

Список файлов диссертации