Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Втретьих, образующийся в ходе ферментативной реакции пероксид водородаспособен восстанавливаться в ходе электрохимических реакций в тех же условиях,что приводит к значительным погрешностям определения [26].Нарядусопределениемкислородаиспользуетсяметоддетекцииобразующегося в ходе ферментативной реакции пероксида водорода, основанныйна его окислении или восстановлении [26]:E S O2 P H 2 O2ВосстановлениеОкислениеH 2O2 2e 2OH H 2O2 2e O2 2H Окисление пероксида водорода связано с использованием высоких значенийрабочего потенциала биосенсора (0.60 – 0.70 В), что влечет усиление мешающего17влияния других восстановителей на отклик ферментного электрода при анализереальных объектов.
Гораздо большей популярностью при создании ферментныхэлектродов пользуется метод определения пероксида водорода, основанный на еговосстановлении, что обеспечивает наивысшую чувствительность и низкий пределобнаружения [27]. Значения рабочих потенциалов биосенсоров в этом случаенаходятся в районе 0.00 В, что позволяет снизить мешающее влияниевосстановителей на отклик.В коммерчески доступных наборах встречается метод, с использованиемфермента пероксидазы для определения пероксида водорода. В таком случае H2O2в присутствии фермента реагирует с N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3метиланилиномсобразованиемокрашенногосоединения,интенсивностьокрашивания пропорциональна концентрации лактата в пробе [28, 29].Помимо этого в литературе описано большое количество методов дляопределения лактата с использованием фермента ЛОД [30-40], в том числе совсемнедавние[41-43].Амперометрическиеустройстванаиболееширокораспространены, в том числе в коммерчески доступных приборах, в табл.
1приведеныаналитическиехарактеристикиосновныхамперометрическихбиосенсоров для определения лактата.Средипотенциометрическихбиосенсоровдляопределениялактатавстречаются твердотельные, на основе иммобилизованной ЛДГ и НАД+ сиспользованиемэлектродах,(3-глицидоксипропил)триметоксисиланапокрытых SnO2/оксидоминдиянастеклянных[44]. Диапазонопределяемыхконцентраций лактата составляет от 6 до 40 мМ, наблюдается высокаячувствительность 61.5 мВ/декада, однако сенсор недостаточно стабилен, после 25измерений сохраняется 84% от исходного значения отклика. Ибупото и соавторыпредставили потенциометрический биосенсор на основе стеклянного электрода снаностержнями ZnO на золотом покрытии, датчик демонcтрирует широкийдиапазон определяемых содержаний лактата (1∙10-6 - 1∙10-3 М), коэффициентчувствительности 41.33 ± 1.58 мВ/декада, время отклика менее 10 с, спустя 21 деньхранения при +4ºС биосенсор сохраняет более 90% от исходного значения [45].18Таблица 1.
Аналитические характеристики биосенсоров для определения лактатаОснова методаПотенциалДОК1С min2ВремяСтабильностьоткликаКоэффициентСсылкачувствительности,мA cм−2∙M−112ЛОД (электроды на0.30 В отн.основе наночастицAg/AgCl30.01 – 2 мМ456.9 мкМ 60 с6При хранении при780.41[43]-[34]4.54[46]40[47]+25ºС 3 мес - 90% 3,при хранении приPt)-30ºС 18 мес – 95%3.ЛОД0.35 В отн.0 – 10 мМ--При хранении всиликагеле при +25ºСAg/AgCl– 8 мес4.ЛОД (электроды,0.45 В отн.0.02 – 1.5содержащиеAg/AgClмМЛОД (электроды на-0.23 В отн.1.4∙10-5 –основе углеродныхHg/Hg2SO43.3∙10-4 М18 мкМ90 сПри хранении при+4ºС - 9 мес4.фталоцианинкобальта)нанотрубок)4.1 мкМ -При хранении при+4ºС – 3 мес4.19Продолжение таблицы 112ЛОД с пероксидазой0.00 В отн.хренаAg/AgCl310 – 180 мкМ410 мкМ5-6После 50 инжекций –7827.7[35]-[48]15.3[49]0.38[32]180[50]90%3. При хранении при+25ºС 4 мес -10%3.ЛОД с ферроцианидом0.40 В отн.(совместноеAg/AgCl1 - 50 мМ1 мкМ5 минПри хранении при +25ºС 7 дней4, при -30ºС – 10мес4.определение лактата иглюкозы)ЛОД (на платиновых0.60 В отн.электродах)Ag/AgCl0.1 – 6 мМ0.5 мкМ 60 сПосле 16 ч непрерывныхизмерений - 84%3.
Прихранении 6 недель при+4ºС– 92%3.ЛОД0.40 В отн.0.1 – 5.5 мМ0.1 мМ50 сПри хранении 26 дней при+4ºС не наблюдаетсяAg/AgClпотери отклика.ЛОД (на электродах,0.00 В отн.модифицированных БЛ) Ag/AgCl1∙10-6 - 5∙10-3 М1 мкМ60 сПосле 500 инжекций –85%3. При хранении 6 меспри +4ºС – 90%3.20Продолжение таблицы 112ЛОД (с наночастицами 0.50 В отн.MnO2)Ag/AgClЛОД (на основе0.00 В отн.углеродных волокон,Ag/AgCl30.02 – 4 мМ48 мкМ535 с6При хранении 1 мес при783.98[33]-42.3[51]При хранении 15 дней0.9[52]0.2[53]+4ºС - 72%3.0.01 – 2 мМ5.6 мкМ60 с1∙10-6 - 5∙10-4 М0.56 мкМ 90 смодифицированныхБЛ)ЛДГ (на основе0.30 В отн.гибридныхAg/AgClпри +4ºС неуглеродныхнаблюдается потеринанотрубок)отклика.ЛДГ0.00 В отн.0.1 - 20 мМAg/AgClПримечания:«-« информация отсутствует.1Диапазон определяемых концентраций лактата.2Предел обнаружения.3Сохраняется % от исходного значения отклика.4Сохраняется активность.0.1 мМ60 с-21Однимизспособовповышениячувствительностиферментативныхбиосенсоров является увеличение количества фермента в распознающем слое, чтообычно делают путем расширения площади рабочего электрода.
Площадьповерхности может быть увеличена благодаря использованию наноматериалов,таких как углеродные нанотрубки [47, 52], наночастицы золота [30, 54],наночастицы платины [55, 56]. Также используются и другие оксиды металлов,такие как оксид ниобия [57], молибдена [58] и наночастицы полупроводниковыхметаллов, например, оксид цинка [59]. Максимально высокая чувствительностьметодов в таком случае достигает 40 мА∙М-1∙см-2 (табл.1).Другой способ повышения чувствительности состоит в использованиибиферментной системы, например совместная иммобилизация пероксидазы хрена илактатоксидазы [35, 60, 61].
В таком случае максимальная чувствительностьбиосенсора достигает 27.7 мA cм−2∙M−1 и измерения проводятся при 0.00 В (табл.1).Наиболее широко для количественного определения лактата в реальныхобразцах используется амперометрическая детекция пероксида водорода. В связи счем большое количество исследований посвящено уменьшению мешающеговлияния восстановителей, присутствующих в биологических жидкостях, т.к. ураты,аскорбаты и другие соединения способны восстанавливаться при потенциалах,близких к потенциалу восстановления H2O2 [62].
Для сведения к минимуму данныхпомех в литературе предложено использование электрокатализаторов, таких какберлинская лазурь (БЛ) [50, 51, 63] или фталоцианин кобальта [46, 64], а такжезамена естественного акцептора электронов - О2 на искусственный медиатор,например, метиленовый зеленый [65], мелдоловый голубой [57, 66], гидроксиметилферроцен [67, 68], комплексы окислительно-восстановительных полимеров осмия[69] и другие (табл. 1). Основным преимуществом использования медиаторовявляется возможность проведения экспериментов при нулевом потенциале, однакобольшинство медиаторов растворимы в водном растворе и токсичны, чтоограничивает их применение в клинической диагностике.Электрокатализаторы широко используются при создании биосенсоров дляопределения лактата, при этом датчики на основе БЛ характеризуютсянаилучшими аналитическими характеристиками.
Коэффициент чувствительности22биосенсоров на основе углеродных волокон, модифицированных БЛ, достигает42.3 мА∙М-1∙см-2, диапазон определяемых концентраций лактата более двухпорядков, однако в литературе не приведена стабильность датчиков [51].Биосенсорыдляопределениялактатанаосновепланарныхэлектродов,модифицированных БЛ, с использованием геля силоксанов для иммобилизацииЛОД по всем аналитическим характеристикам превосходят известные аналоги(табл.1).
А именно, коэффициент чувствительности датчиков в несколько разпревышает значение любых подобных устройств и достигает 180 мА∙М-1∙см-2,диапазон определяемых содержаний лактата шире, чем у известных аналогов, исоставляет более трех порядков от 1∙10-6 до 5∙10-3 М. Время отклика 60 с, чтосопоставимо с аналогами, а операционная стабильность и стабильность прихранении наравне или выше, чем у подобных устройств. При этом измеренияпроводятся при нулевом потенциале, что позволяет избежать мешающее влияниевосстановителей при анализе реальных объектов [50].Таким образом, существует множество методов определения лактата, средикоторых предпочтение отдается ферментативным методам, как обладающимнаивысшей специфичностью, точностью и воспроизводимостью результатов.Анализ литературных данных показал, что биосенсор для определения лактата наоснове планарных электродов, модифицированных БЛ, с использованием гелясилоксанов для иммобилизации ЛОД по всем аналитическим характеристикампревосходит известные аналоги.
Тем не менее, остается вопрос повышениястабильности ферментных биосенсоров в связи с лабильностью фермента с цельюдлительного использования и хранения аналитических устройств, что являетсянеотъемлемым составляющим коммерческого применения биосенсоров.1.3. Неинвазивный мониторинг лактатаВ процессе физических нагрузок в организме человека происходятизменения физиологического и биохимического характера, что привлекаетвнимание исследователей уже более ста лет. В 1927 году Дугласом и соавторамибыло описано увеличение содержания лактата в крови при некоторой физическойнагрузке, а вместе с тем понижение концентрации бикарбонатных ионов иусиление дыхания [70].
Позднее Холман [71], а затем Вассерман [72] разработали23концепцию«порогаанаэробнойнагрузкиорганизма»,связавповышениеконцентрации лактата с возникающим кислородным долгом.В настоящее время лактат определяют в крови, для этого кровь берут изпальца или из мочки уха. Для получения полной информации необходимнепрерывный мониторинг лактата в организме, что сложно осуществимо, потомучто требуется регулярный отбор крови, а это зачастую вызывает дополнительноенапряжение и может влиять на результаты тренировок. Непрерывный мониторинглактата необходим как для спортсменов во время интенсивных физическихнагрузок, так и для пациентов в процессе интенсивной клинической терапии.Необходимость непрерывного определения лактата в организме человека инынешняятенденцияразвитиянеивазивныхметодованализапобудилиисследователей изучить изменение концентрации лактата в других жидкостях тела.Неинвазивные методы исследования и лечения не нарушают целостности кожныхи слизистых покровов, и, тем самым, исключают заражение и травматизм.Химический анализ образцов с целью неинвазивной диагностики требует наличиеэкскреторнойжидкости,выделяемойразличнымиорганамичеловекадлявыведения ненужных или даже вредных веществ.В литературе приведено, что концентрация лактата в крови коррелирует ссодержанием аналита в тканевой жидкости, но данный анализ относится кмалоинвазивным [73].
Существует множество жидкостей, выделяемых человеком,такие как: слюна, моча, пот, конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ), слеза идругие, однако решающим фактором при химическом анализе экскреторныхжидкостей с целью неинвазивного определения лактата в организме человекаявляется корреляция его содержанию с кровью.В литературе описаны случаи определения лактата в образцах слюны [74,75], но встречаются данные как о высокой [75, 76], так и о низкой [77] корреляциисодержания лактата в слюне и в крови, а также наличие бактерий [78]. Проведеныисследования по определению содержания лактата в конденсате выдыхаемоговоздуха, направленные на замену объекта исследования с крови мочки уха на КВВ.Марек и соавторы утверждают о корреляции содержания лактата в крови соскоростью накопления метаболита в КВВ (R2 = 0.7423), однако данный вопрос ещетребует уточнений [79, 80].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
