Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Ломоносова. Работа с использованиемсканирующего электрохимического, электронного и лазерного микроскопов,изготовление гибких планарных микроэлектродов проводились автором подруководством Dr. Fernando Cortes-Salazar, Dr. Andreas Lesch и Prof. Hubert Girault влабораториифизическойианалитическойэлектрохимииполитехнической школы Лозанны (Швейцария) во время стажировки.федеральной12ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫГлава 1.
Лактат1.1. Актуальность определения лактатаМолочная кислота, а другими словами лактат, входит в число наиболееважных аналитов, поскольку является универсальным продуктом обмена веществпрактически у всех живых организмов, конечным продуктом тканевого обменаглюкозы при нехватке кислорода, основным межклеточным энергетическимвеществом в тканях мозга [1], а также натуральным компонентом вин и другихпищевых продуктов, что используется для оценки их качества [2, 3].Молочная кислота в организме человека образуется при распаде глюкозы.Глюкозу иногда называют «кровяным сахаром» и именно она является основнымтопливом для нервной системы, мозга, а также для мышц во процессе физическойнагрузки.
Расщепление глюкозы способствует производству аденозинтрифосфата(АТФ), который в свою очередь обеспечивает энергией большинство химическихреакций в организме [4, 5]. Лактат образуется из пирувата под действиемлактатдегидрогеназы (ЛДГ) на последней стадии гликолиза в соответствии среакцией:НАДН + Н+НАД+,где НАД – никотинамидадениндинуклеотид.Практически все клетки организма вырабатывают лактат, при этомнаибольшее содержание метаболита обеспечивают ткани кишечника, мозга, атакже скелетные мышцы. Нормальная концентрация лактата в крови варьируется впределах 0.5 - 2.2 ммоль/л [6-9], однако при интенсивных физических нагрузкахуровень лактата в крови может повышаться в 10 раз по сравнению с базовым,демонстрируя,такимобразом,напряженностьметаболическихпроцессоваэробного и анаэробного гликолиза.
Данный факт определяет интерес к уровнюлактата в крови в спортивной медицине. Динамика роста концентрации лактата13позволяет определять наиболее перспективных спортсменов в видах спорта навыносливость, таких как: бег, велоспорт, лыжные гонки и другие. Такжеважнейшим физиологическим показателем является анаэробный (лактатный)порог, о котором впервые было опубликовано Овлесом в 1930 году, именно пороготражаетуровеньтренированности организма и взаимоотношение междуаэробными и анаэробными путями энергообеспечения физической нагрузки [10].Чем выше анаэробный порог, тем более тренирован спортсмен, и его организмимеет более развитую аэробную систему энергообеспечения, мощность которойможет составлять от 80 до 90% от максимального потребления кислорода.
Сбиохимической точки зрения анаэробный порог наблюдается при повышенииуровня лактата в крови до 4 – 10 ммоль/л [7, 11]. Данные по концентрации лактатакрови в процессе физических упражнений позволяют классифицировать режимыинтенсивности беговых или иных нагрузок у спортсменов и, как следствие,повыситьвозможностиреализациифункциональныхитренировочныхпотенциалов. В настоящее время измерение частоты сердечных сокращений (ЧСС)и уровня лактата в крови является неотъемлемым элементом тренировки упрофессиональных спортсменов.Рост содержания лактата в крови при физических нагрузках разнится сувеличением концентрации метаболита у критических больных, описанным Дж.Мекинс и С.
Лонг в 1927 году [12]. Уже тогда было показано, что повышениеконцентрации лактата в крови свидетельствует о гипоксии тканей у пациентов ссердечно-сосудистым шоком. А также у пациентов с клиническим шоком,связанным с тахикардией, артериальной гипотензией, холодной и липкой кожей иснижением диуреза, уровень лактата был принят как лучший объективныйпоказатель тяжести заболевания [13]. Резкое увеличение (в 2 - 3 раза) уровнялактатавсывороткекровинаблюдаетсяпритяжѐлыхрасстройствахкровообращения, таких как геморрагический шок, острая левожелудочковаянедостаточность и другие, когда одновременно страдает и поступление кислородав ткани и печеночный кровоток.Важное значение лактат приобрел и в пищевой промышленности, гдемолочная кислота присутствует в качестве натурального компонента во многихпродуктах. Лактат образуется при молочнокислом брожении сахаров, в частности,14в прокисшем молоке, йогурте, сыре, при брожении вина, пива, кваса. Такжевыступает в качестве консерванта, пищевая добавка E270.
Определение лактата впродуктах используется для оценки и контроля качества производственного сырьяи пищевых продуктов.Таким образом, содержание лактата в крови в клинической диагностикеимеет жизненно важное значение, в спортивной медицине оно являетсяпоказателем эффективности физических нагрузок, а в пищевой промышленностиопределение лактата необходимо для контроля качества пищевых продуктов.
Вседанные отрасли широко распространены и, несомненно, определение лактата оченьактуально. Методы определения, характеризующиеся высокой чувствительностью,селективностью, широким диапазоном определяемых концентраций лактата идлительной операционной стабильностью представляют большой интерес.1.2. Методы определения лактатаВпервые возможность определения лактата в крови млекопитающихпродемонстрировал Гаглио 1866 году [14], однако результаты были получены сиспользование крови собак и кроликов после вскрытия вен. Позднее Берлинерблаув 1877 году подтвердил эти наблюдения у млекопитающих и впервые определилконцентрацию лактата в венозной крови человека [15].
Тогда для анализатребовалось почти 200 мл крови. Сейчас же для определения концентрации лактатасуществует множество методов и для проведения анализа достаточно 100-150 мклкрови.Беркером и Самерсоном было предложено колориметрическое определениелактата в биологических пробах [16]. В присутствии серной, фосфорной кислот исолей меди из лактата образуется уксусный альдегид, который реагирует спараоксидифенилом с образованием окрашенного в фиолетовый цвет соединения.Интенсивность окраски пропорциональна концентрации лактата в пробе, чторегистрируют спектрофотометрически при длине волны 340 нм.
Данный методшироко применяется в лабораторной практике, однако требует длительнуюпробоподготовку и сложное аппаратное обеспечение, при этом диапазонопределяемых содержаний лактата составляет чуть более одного порядка от 1∙10-5до 1.3∙10-4 М.15Встречаютсяметодыопределениялактатасиспользованиемвысокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [17, 18]. При этомавторы сначала проводят разделение на колонке с обращенной фазой, затемэкстракциювнесколькоступеней,послечеголактатопределяютвультрафиолетовом диапазоне (242 и 320 нм) путем дериватизации с αбромацетофеноном. Диапазон определяемых концентраций лактата в таком случаесоставляет 0.18 - 6.0 мМ.Лактат и другие метаболиты измеряли методом спектроскопии протонногомагнитного резонанса в клетках мозга у пациентов, переживших инфаркт [19].
Вдругих источниках исследовали среду культивированных клеток на глюкозу,лактат и аммиак в ближней инфракрасной спектроскопии в спектральномдиапазоне 2.0 – 2.5 мкм [20]. Также известны методы определения лактата кальцияметодом комплексонометрического титрования [21, 22].Однако, при наличии достаточного разнообразия методов определениялактата, предпочтение отдается ферментативным методам относительно всехвышеприведенных. Ферментативные методы определения лактата основаны накаталитическом действии ферментов лактатоксидазы и лактатдегидрогеназы, онипросты в применении, но обеспечивают наивысшую специфичность, точность ивоспроизводимость.
Первое определение лактата с использованием ферменталактатдегидрогеназы было основано на переносе водорода от лактата кгексацианоферрату калия, однако метод был сложен в исполнении и не получилширокогораспространения.Последующиеспособыбылиоснованынаультрафиолетовом измерении образовывающегося в ходе ферментативной реакцииНАДН в соответствии с:лактатдегидрогеназаЛактат + НАД+ Пируват + НАДНВ 1974 году Гутманом и Вахлефидом было описано определение лактата поНАДН, выделяющегося в ходе ферментативной реакции, с использованиемгидразина в качестве улавливающего агента для пирувата [23].
Нолл такжедетектировал лактат с использованием лактатдегидрогеназы, но в реакционнойсмеси присутствовала еще аланинаминатрансфераза, используемая для болеебыстрого удаления пирувата [24].16Однако, определение лактата по НАДН довольно затруднительно прианализе реальных объектов, что нельзя сказать о реакции, катализируемойлактатоксидазой, когда лактат можно определять по расходующемуся кислороду,либо по окислению или восстановлению пероксида водорода, выделяющегося входе ферментативной реакции:лактатоксидазаЛактат + O2 Пируват + H2O2Первым датчиком, работающим на данном принципе, был биосенсор дляопределения глюкозы с использованием фермента глюкозооксидаза (ГОД).Сообщение о его создании было сделано в 1962 году на заседании Нью-ЙоркскойАкадемии Наук учеными Кларком и Лайонсом [25].
Они поместили ГОД в ячейку скислородным электродом, ток восстановления кислорода на платиновом электродепри–0.60В(здесьивездедалеепотенциалуказанотносительнохлоридсеребряного электрода сравнения) пропорционален концентрации глюкозыв образце, что позволило проводить определение последней в широком диапазонеконцентраций. Однако определение глюкозы через количество поглощенного входе реакции кислорода обладает рядом недостатков. Во-первых, в равновесии своздухом концентрация кислорода в водных растворах высока (0.2 мМ), чтозатрудняет определение низких концентраций анализируемых веществ. Во-вторых,в реальных объектах равновесная концентрация кислорода может изменяться.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
