Высокоэффективные лактатные биосенсоры на основе инженерии иммобилизованной лактатоксидазы (1105559), страница 2
Текст из файла (страница 2)
С этой точки зрения интерес вызывает пот, так как показано, что увеличениеконцентрации лактата в крови коррелирует с увеличением содержания аналита впоте. В процессе тяжелых спортивных тренировок содержание лактата в потедостигает 40 - 80 мМ, а вместе с тем, верхняя граница определяемых содержанийлактатасиспользованиемнаилучшегоизвестноголактатногобиосенсорасоставляет 5 мМ; то есть, определение аналита в поте можно проводить толькопутем разбавления образца в 100 и более раз, что не представляется возможнымпри on-line мониторинге.Таким образом, было необходимо разработать лактатные биосенсоры,характеризующиеся длительной стабильностью, высокой чувствительностью ивоспроизводимостью, с возможностью расширения диапазона определяемыхконцентраций в область высоких значений с целью создания неинвазивногомонитора на лактат.Цельработысостоялавсозданиивысокоэффективныхлактатныхбиосенсоров на основе инженерии лактатоксидазы при иммобилизации длявозможности определения лактата в различных диапазонах содержания, вчастности при разработке неинвазивного монитора состояния гипоксии.Достижение поставленной цели предусматривало решение следующихзадач: адаптация метода сканирующей электрохимической микроскопии дляопределения пероксида водорода, выделяющегося в ходе ферментативнойреакции, с целью скрининга ферментсодержащих мембран; исследованиеферментсодержащихаминопропилсилоксанаразличноймембранплотностинасцельюосновеγ-нахожденияоптимального состава смеси для иммобилизации фермента и создания7высокочувствительного и высокостабильного биосенсора для определениялактата; использование перфторсульфонированного полимера для иммобилизациилактатоксидазы с целью понижения сродства фермента к субстрату и, темсамым, расширения диапазона определяемых концентраций лактата вобласть высоких значений, необходимых для анализа неразбавленного пота; нахождениеоптимальногосодержанияγ-аминопропилсилоксанаиперфторсульфонированного полимера в водно-органической смеси дляиммобилизацииферментадлясозданиябиосенсора,позволяющегоопределять физиологические содержания лактата в поте (5 - 80 мМ); интеграция полученного биосенсора на высокие концентрации лактата внеинвазивный монитор для определения лактата в поте непосредственно споверхности кожи в режиме реального времени; апробация неинвазивного лактатного монитора для анализа пота в режимереального времени в состоянии покоя и при физической нагрузке, сравнениерезультатов анализа с данными, полученными альтернативным методом.Научная новизна.Адаптирован метод сканирующей электрохимической микроскопии сиспользованиемвысокостабильногомикроэлектрода,модифицированногоберлинской лазурью, для выявления профиля концентрации пероксида водорода.
Спомощью сканирующего электрохимического микроскопа проведен скринингферментсодержащих мембран различного состава и установлено оптимальноесодержаниеγ-аминопропилсилоксанаиммобилизациилактатоксидазы,привводно-органическойиспользованиикоторогосмесидлядостигаютсянаивысшие показатели чувствительности и стабильности лактатных биосенсоров.По чувствительности биосенсор (0.33·A·M-1·cм-2) в четыре раза превосходитлучший известный датчик для определения лактата. Стабильность разработанногобиосенсора в два раза выше в сравнении с наилучшим известным лактатнымдатчиком.Предложеноиспользоватьотрицательнозаряженныйперфторсульфонированный полимер при иммобилизации лактатоксидазы для8экранирования субстрат-связывающего участка, с целью понижения сродстваферментаксубстрату.Использованиеперфторсульфонированного полимераисмешанныхмембранγ-аминопропилсилоксанаизпозволилорасширить диапазон определяемых концентраций лактата в область более высокихзначений вплоть до 80 мМ в периодическом режиме тестирования, что покрываетфизиологическое содержание аналита в поте.
После трех часов непрерывныхизмерений уровень сигнала биосенсора остается на первоначальном уровне.Кажущаяся константа Михаэлиса лактатоксидазы достигает 10.4 мМ, что в 30 развыше, чем при использовании электронейтральных силоксановых мембран дляиммобилизации фермента.Разработанасистемадлянепрерывногонеинвазивногомониторингасостояния гипоксии. Достоверность результатов по содержанию лактата в поте всостоянии покоя и в процессе физической нагрузки, полученных при апробациинеинвазивного монитора, подтверждена с помощью альтернативного метода.Практическая значимость.Разработан высокостабильный микроэлектрод для определения пероксидаводорода, используемый в качестве зонда для сканирующей электрохимическоймикроскопии.Коэффициентчувствительностимикроэлектрода,модифицированного берлинской лазурью, составляет 1.6 А·М-1·см-2, линейныйдиапазон определяемых концентраций пероксида водорода от 1∙10-5 до 1∙10-2 М.Показана высокая операционная стабильность даже в очень жестких условиях (1мМ H2O2): после двух часов непрерывных измерений сенсор не теряетчувствительности, а спустя 17 ч работы остается более 67% от первоначальнойвеличины сигнала.Создан высокочувствительный и высокостабильный лактатный биосенсор наосновеферментсодержащихмембранизγ-аминопропилсилоксанасаналитическими характеристиками в периодическом режиме тестирования:коэффициентчувствительности0.33·A·M-1·cм-2,диапазонопределяемыхконцентраций лактата 1·10-6 - 5·10-3 М, время отклика – 40 с.
Продемонстрированавысокая операционная стабильность: величина отклика биосенсора после двухчасов непрерывных измерений остается не менее 85% от первоначального9значения. Также отмечено, что при хранении в течение 18 мес в холодильнойкамере биосенсор сохраняет по крайней мере 80% от исходного значениячувствительности.Разработан лактатный биосенсор на основе смешанных мембран из γаминопропилсилоксанаиперфторсульфонированногополимерадляиммобилизации лактатоксидазы, позволяющий проводить определение лактата внеразбавленном поте.
Аналитические характеристики в системе проточноинжекционного анализа: диапазон определяемых концентраций лактата 1·10-5 5·10-1 M, коэффициент чувствительности 0.77 мA·M-1·cм-2, время отклика 2 мин; впериодическом режиме тестирования: диапазон определяемых концентрацийлактата 0.1 – 80 мМ, коэффициент чувствительности 1.13 мA∙M-1∙см-2, времяотклика 1 мин. Показана высокая операционная стабильность: после трех часовнепрерывных измерений биосенсор не теряет сигнала. При хранении в течение 3мес при +4ºС сохраняется исходное значение чувствительности.Создан лабораторный образец неинвазивного монитора состояния гипоксии.Разработанный образец применим для непрерывного определения лактата в потенепосредственно с поверхности кожи в состоянии покоя и в процессе физическойнагрузки. Коэффициент корреляции результатов анализа с данными, полученнымиальтернативным методом составил 0.9930.Положения, выносимые на защиту:1.
Использование сканирующей электрохимической микроскопии в качественового метода скрининга ферментсодержащих мембран различного составадля улучшения аналитических характеристик биосенсора для определениялактата.2. Созданиебиосенсоравысокочувствительногонаосновеивысокостабильногоγ-аминопропилсилоксаналактатноговкачествемембранообразующего соединения для лактатоксидазы.3.
Новыйспособпониженияаффинностилактатоксидазыклактату,основанный на экранировании субстрат-связывающего участка отрицательнозаряженным перфторсульфонированным полимером при иммобилизации10ферментанаповерхностьэлектрода,длярасширениядиапазонаопределяемых концентраций лактата в область высоких значений.4. Созданиебиосенсораконцентрацийдлялактатасопределениявысокихиспользованием(миллимолярных)γ-аминопропилсилоксанаиперфторсульфонированного полимера для иммобилизации фермента.5. Разработкаконструкциинеинвазивногомониторапутеминтеграциибиосенсора, тонкослойной ячейки и потосборника.6.
Создание неинвазивного монитора состояния гипоксии; новый способопределения лактата в поте в состоянии покоя и при физической нагрузке врежиме реального времени.Апробацияработы.Основныерезультатыдиссертационнойработыопубликованы в 3 статьях в зарубежных рецензируемых научных журналах:1. M.
M. Pribil1, G. U. Laptev, E. E. Karyakina, and A. A. Karyakin. Noninvasivehypoxia monitor based on gene-free engineering of lactate oxidase for analysis ofundiluted sweat // Anal. Chem. 2014.V. 86 (11). P. 5215–5219.2. M. M. Pribil, F. Cortés-Salazar, E. A. Andreyev, A. Lesch, E.
E. Karyakina, O. G.Voronin, H. H. Girault, A. A. Karyakin. Rapid optimization of a lactate biosensordesign using soft probes scanning electrochemical microscopy // J. Electroanal.Chem. 2014. V. 731. P. 112–118.3. S. Rastgar, H. Deng, F. Cortes-Salazar, M. D. Scanlon, M. M. Pribil, V. Amstutz,A. A. Karyakin, S.
Shahrokhian and H. H. Girault. Oxygen reduction at softinterfacescatalyzedbyinsitu-generatedreducedgrapheneoxide//ChemElectroChem. 2014. V. 1(1). P. 59–63.и доложены на 4 международных и российских научных конференциях:1. Мчедлишвили М. М2. Биосенсор для определения лактата в неразбавленномпоте / ΧІΧ Международная конференция студентов, аспирантов и молодыхученых «Ломоносов – 2012».
Москва. 2012.2. Мчедлишвили М. М. Изменение способов иммобилизации фермента дляразработки высокочувствительного биосенсора для определения лактата /1-2Автор сменила фамилию с Мчедлишвили на Прибиль в 2013 г.11ΧΧ Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых«Ломоносов – 2013».
Москва. 2013.3. Мчедлишвили М. М., Карякин А. А. Высокочувствительный биосенсор дляопределениялактата.электрохимическойИспользованиемикроскопиидляметодасканирующейисследованияаналитическиххарактеристик биосенсоров / Второй съезд аналитиков России.
Москва. 2013.C. 465.4. Прибиль М. М. Неинвазивный монитор оценки гипоксии на основеинженериилактатоксидазыМеждународная«Биосенсорныедлявыставкасистемыанализанеразбавленного«АналитикадляЭкспоклинической2015».диагностикипота/Семинариохраныокружающей среды». Москва. 2015.Вклад автора в представленную работу.В основу диссертации положены результаты научных исследований,выполненных непосредственно автором в период 2012 - 2015 гг. Личный вкладсоискателя заключается в постановке задач исследования, планировании ипроведении экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов,подготовке публикаций по теме диссертации, а также формулировке защищаемыхнаучных положений и выводов. Основная часть работы была выполнена автором влабораторииэлектрохимическихметодовкафедрыаналитическойхимиихимического факультета МГУ имени М. В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
