Автореферат (1097598), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Статистический и бионформационный анализыполученных экспериментальных данных были выполнены также лично автором.Апробация результатов. Результаты работы докладывались на научных семинарах ЦентраСистемной Биологии Эдинбурского университета и Абертей университета, г. Данди,Великобритания, а также были представлены на 17 международных конференциях.ПубликацииПо теме диссертации опубликовано 22 статьи в рецензируемых научных изданиях, изкоторых 18 входят в библиографические базы Scopus (15) и Web of Science (3), а также 3 главы7в коллективных монографиях.Структура и объем работыДиссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, 4 приложений и спискацитированной литературы.Основное содержание работыВо введении кратко обсуждаются современные проблемы лекарственной онкотерапии,сформулированы актуальность темы диссертации, цели и задачи исследования, показанынаучная новизна и практическая значимость работы, перечисляются положения, выносимыена защиту.В первой главе приводится литературный обзор основных методовперсонализированной ЛОТ и обсуждаются результаты применения подхода компьютернойсистемной биологии к исследованию клеточных сигнальных путей и его использования вразработке эффективных ЛП в онкологии.Во второй главе дается описание разработанного метода компьютерногомоделирования влияния онкомутаций на эффективность действия лекарственных препаратов,ингибирующих сигнальные пути опухолевых клеток.

Метод развит для анализа действияингибитора активации рецепторного комплекса ErbB2/ErbB3, пертузумаба, в ERK и PI3Kсигнальных путях при различных мутациях генов, кодирующих белки в этих путях. С цельюисследования ответа сигнальной сети на действие ЛП разработана кинетическая модель еефункционирования при активации клеточных рецепторов ErbB3 при его связывании слигандом, нейрегулином-1-HRG. Схема модели приведена на Рис.

1. Модель представляетсобой систему обыкновенных дифференциальных уравнений (ОДУ), описывающих кинетикуактивации рецепторного сигнала и его передачу в системы:(1)= − − {( )= , ( , , ) − , ( , , ),(2)где уравнения (1) и (2) описывают, соответственно, кинетику образования рецепторных ибелковых комплексов Si, а также кинетику фосфорилирования и дефосфорилированиясигнальных белков и белковых комплексов системы, pSi. Скорости реакцийфосфорилирования Vp,i(Si,Sj,pi) и дефосфорилирования Vd,i(pSi,Sk,pi) сигнальных белковописываются методами ферментативной кинетики.

Для определения кинетическихпараметров модели были использованы данные in vitro экспериментов по кинетике активациии ингибированию ERK и PI3K сигнальных путей в линии клеток опухоли яичников PE04.Экспериментальные работы были выполнены участниками проекта в Центре Исследованиярака Эдинбургского университета. В экспериментах измерялась кинетика фосфорилированияосновных сигнальных белков при активации клеток 1 нМ HRGв отсутствии и присутствииингибитора.

Кинетические параметры модели определялись на основе наилучшего согласиярасчетных и экспериментальных кинетических кривых с использованием вычислительныхметодов минимизации квадратичных отклонений. Для ряда известных кинетическихпараметров реакций образования молекулярных комплексов и реакций фосфорилирования8белков были использованы литературные данные.С целью детального описания кинетики сигнальных белков и их взаимодействия с ЛПбыл развит метод моделирования функционирования отдельных ферментов системы на основеin vitro экспериментальных данныхРис.

1. Схема модели RAS/MEK/ERK и PI3K/AKT/mTOR/S6K1 сигнальных путей,активируемых в результате димеризации ErbB2 (HER2) и ErbB3 (HER3) рецепторов.Пунктирными линиями показаны отрицательные обратные связи, учтенные в модели.Показаны также ингибиторы, исследованные в модели: ингибитор ErbB2 рецепторов,пертузумаб (2С4 моноклональное антитело); ингибитор киназы PI3K, LY294002; ингибиторmTOR1 комплекса, рапамицин и препарат двойного действия, BEZ235, ингибирующий PI3K иmTOR1,2.(см.

схему на Рис. 2). Разработанный метод позволяет интегрировать в кинетическую модельфермента экспериментальные данные, полученные в различных экспериментальных условиях.Данный метод позволяет повысить точности определения кинетических параметровферментов и их ингибиторов за счет использования расширенного набора экспериментальныхточек. Также при разработке моделей отдельных ферментов учитывались экспериментальныеданные по молекулярной структуре фермент-субстратного и фермент-ингибиторногокомплексов, что позволило дискриминировать различные механизмы катализа и действияингибиторов на этапе разработки кинетических моделей. В данном методе надежностьмоделей отдельных ферментов тестировалась путем проверки предсказательных способностеймоделей на основе дополнительных экспериментальных данных, в частности, дозовыхзависимостей активностей ферментов от концентрации субстратов, а также зависимостейзначений IC50 для ЛП от концентраций субстратов.

Разработанный метод был успешноприменен для описания сложной кинетики отдельных ферментов, функционирующих в9различных сигнальных системах клетки. Полученные результаты данного этапа былиопубликованы в следующих работах [1,3,8,9,16,18]. Разработанные модели сигнальных белковиспользованы в полной модели сигнальных систем клетки с целью повышения ее надежностии предсказательной способности. Сравнение действия лекарств на клеточном уровне сданными полученными на отдельных белках, выделенных из клеточного экстракта, позволяетанализировать системные эффекты, влияющие на эффективность действия ЛП на клеточномуровне.Результаты расчетов кинетики фосфорилирования ErbB2 (pErbB2), AKT (pAKT), PI3K(pPI3K) и кинетики PIP2 (фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата) приведены на Рис.

3. Анализполученных результатов показал, что модель удовлетворительно описывает динамику PI3Kсигнальной системы при активации ErbB рецепторов лигандом HRG. Разработанная модельбыла применена к исследованию действия ЛП пертузумаба, моноклонального антитела (2C4),ингибирующего димеризацию ErbB2/ErbB3 рецепторов. Как показали результаты расчетов,пертузумаб является эффективным ингибитором активации AKT сигнала. Его связывание сErbB2 рецептором приводит к ингибированию 70% и 90% фосфорилирования ErbB2,соответственно, на 5 мин и 60 мин после начала действия ингибитора. Это приводит кподавлению активации PI3K киназы, низкому уровню синтеза PIP3 и, как следствие, кингибированию активации AKT сигнала.

Как видно, пертузумаб вызывает 50% и 80%ингибирование pAKT, соответственно, на 10 мин и 60 мин после начала действия ингибитора(Рис. 3).Рис. 2. Схема метода разработки кинетических моделей отдельных сигнальных белков.Метод включает модель каталитического цикла фермента, дискриминацию механизмадействия ингибиторов и калибровку модели на основе набора in vitro экспериментальныхданных, определение кинетических параметров ферментов и ингибиторов, а такжевалидацию моделей на основе дополнительных экспериментальных данных.Анализ результатов расчетов показал, что основным управляющим элементом в даннойсистеме является цикл PIP2/PIP3, в котором синтезируется PIP3, сигнальных липид,участвующий в начальной стадии активации AKT (Рис.

1). Этот цикл находится подуправлением киназы PI3K и фосфатазы PTEN – белков, для которых обнаружена высокаячастота мутаций в онкологии молочной железы и яичников (около 30%). Мутации гена10PIK3CA вызывают повышенную активность PI3K киназы, в то время как мутации PTEN генаприводят к делеции или пониженной фосфатазной активность PTEN.

С целью выяснениявлияния мутаций генов PIK3CA и PTEN на действие ингибиторов рецепторов был исследованответ сигнальной системы на ингибирование рецепторного сигнала при различныхконцентрациях сигнальных белков. Показано, что при нормальном уровне экспрессии PTENпертузумаб ингибирует активацию рецепторного сигнала pErbB2, что вызывает эффективноеингибирование выходного сигнала сиcтемы pAKT (Рис.

3). При уменьшении экспрессии PTENболее чем на 50% ингибирование ErbB2 рецептора не вызывает ингибирование pAKT вобласти физиологических концентраций пертузумаба 100 нМ (Рис. 3).AВAДAБAГЕДAРис. 3. Результаты компьютерного моделирования кинетики активации и ингибированияPI3K/PTEN/AKT сигнального пути в опухолевой линии PEO4 клеток яичников. КинетикаpErbB2 (A), pPI3K (Б), pAKT (В) и PIP2 (Г) при активации HRG ( ) и ингибировании ЛПпертузумабом (2C4) (). Результаты моделирования действия ЛП пертузумаба приингибировании активности PTEN (50 nM bpV(pic)) на кинетику pAKT (Д) и PIP2 (Е). Точки экспериментальные данные для pErbB2(Tyr877), pAKT(Ser437) при 1 нM HRG, 100 нМпертузумаба и 50 нM bpV(pic) [17].С целью проверки полученных теоретических результатов были проведены11эксперименты, в которых потеря активности PTEN вызывалась путем ингибированияфосфатазы специфическим ингибитором bpV(pic).

Экспериментальные работы быливыполнены участниками проекта в Центре Исследования Рака Эдинбургского университета.Сравнение теоретических и экспериментальных результатов показало, что PI3K сигнальнаясистема теряет чувствительность к ингибирующему действию пертузумаба при уменьшенииактивности PTEN (Рис. 3). Расчеты также показали, что система теряет чувствительность кингибированию рецепторов при увеличении активности киназы PI3K (> 2 раз), вызванноймутациями гена PIK3CA, а также повышенной экспрессией киназы AKT.На основе аналитического анализа кинетики цикла PIP2/PIP3 введен управляющийпараметр системы γ, который приближенно можно оценить, как отношение активностейуказанных белков: γ=PTEN/PI3K/AKT. На Рис.

Характеристики

Список файлов диссертации