Автореферат (1097598), страница 9
Текст из файла (страница 9)
19). Сенсорная система включает в себя процесс формированиякомплекса NRF2 с белком KEAP1 (NRF2-KEAP1), что приводит к деградация NRF2.Окисление KEAP1 в результате действия H2O2 приводит к диссоциации комплекса NRF2KEAP1 и накоплению NRF2 в ядре клетки. Генетическая система регуляции в моделивключает процессы диффузии NRF2 в ядро клетки; формирование активационного NRF2-MAFи репрессорного MAF-MAF факторов транскрипции в результате связывания NRF2 с белкомMAF; связывание факторов транскрипции с ARE промотерными сайтами DNA, а такжеактивацию и репрессию экспрессии NRF2-зависимых ферментов АОС. В моделиантиокислительная система клетки включает следующие ферменты, регулирующиеокислительно-восстановительный потенциал клетки: тиоредоксин перексидазу, тиоредоксин,тиоредоксин редуктазу, глутатион перексидазу, глутатион и глутатион редуктазу.Отрицательная обратная связь в модели формируется за счет окисления белка KEAP1, чтоприводит к диссоциации комплекса NRF2-KEAP1 и накоплению NRF2 в ядре, что вызываетповышение экспрессии ферментов АОС клетки.
Другая петля ООС в модели формируется за31счет восстановления окисленного белка KEAP1 ферментами АОС, что приводит кобразованию комплекса NRF2-KEAP1 и деградации NRF2 в цитоплазме.Развитая модель была применена к описанию функционирования NRF2-зависимойсигнальной системы в следующих раковых клетках яичников OVCAR3, OVCAR4, PEO1, PEO4,PEO6 и SKOV3 с различным уровнем экспрессии белков NRF2 и KEAP1. Экспериментальныеработы по проверке теоретических расчетов были проведены коллаборатором проекта вАбертей Университете [5,6]. Результаты моделирования сенсорной NRF2-KEAP1 системыприведены на Рис.
20А, где показана кинетика деградации NRF2 в результате окисленияKEAP1 в 7 клеточных линиях при отсутствии генетической регуляции при действииингибитора транскрипции CXH. Результаты моделирования антиоксидантной системы клеткиприведены на Рис. 19Б, где приведена кинетика деградации H2O2 при действии ферментовАОС. Видно, что начальная стадия деградации H2O2 сопровождается увеличением экспрессиитиоредоксин перексидазы (Pxtot) и ее окислением (Pxox).
Модель антиоксидантной системыраковых клеток была опубликована в работах [3, 10].АБРис. 20. (А) Функционирование сенсорной NRF2-KEAP1 антиокислительной системыклетки: деградация NRF2 в результате образования комплекса NRF2-KEAP1 в клеточныхлиниях с различным соотношением NRF2/KEAP1: HaCaT ( ), PEO1 ( ), SKOV3 ( ), PEO6( ), OVCAR3 ( ), PEO4 ( ), OVCAR4 ( ). Точки – соответствующие экспериментальныеданные.
(Б) Функционирование антиоксидантной системы: кинетика деградация H2O2 ( ),восстановленного Pxred ( ), окисленного Pxox ( ) фермента пероксидазы при добавлении всистему 5 M H2O2 в нулевой момент времени. Точки – экспериментальные данные дляHaCaT ( ) и OVCAR3 ( ) клеток [5].Для учета генетической регуляции в работе развита кинетическая модель экспрессиюNRF2-зависимых белков АОС. Модель включает следующие ОДУ, описывающие кинетикуформирования активационного NRF2-MAF и репрессорного MAF-MAF факторовтранскрипции, а также их связывание с ARE сайтами DNA, NRF2-MAF-ARE и MAF-MAFARE:32_= 1 ( ∙ − 1 _)2_= 2 ( ∙ 2 − 2 2_ )2__= 3 (2_ ∙ − 2 ∙ 2__)__= 4 (_ ∙ − 2 ∙ __)Расчеты были выполнены с экспериментальными значениями констант скоростей реакций идиссоциации для активационного и репрессорного комплексов и их связывания спромотерными сайтами. Расчеты показали, что баланс между активационным и репрессорнымкомплексами факторов транскрипции нарушается при возрастании концентрации NRF2 в ядреклетке при повышении уровня H2O2, что приводит к увеличению экспрессии ферментовантиоксидантной системы клетки (Рис.
21А).На основе разработанной модели была рассчитана регуляторная характеристика NRF2KEAP1 сигнальной системы: зависимость концентрации NRF2 от внутриклеточного уровняH2O2 (Рис. 21Б). При низких концентрациях H2O2 в клетке наблюдается низкий уровень NRF2за счет деградации NRF2 в комплексе NRF2-KEAP1. При возрастании внутриклеточнойконцентрации H2O2 регуляторная кривая имеет гистерезисный характер, что соответствуетфункционированию сенсорной и регуляторной подсистем NRF2-KEAP1-сигнальной системы.В этой области концентраций H2O2 происходит накопление фактора транскрипции NRF2,формирование активационного комплекса NRF2-MAF в ядре клетки и инициациятранскрипции ферментов АОС клетки.
Механизм регуляции отключается при достижениимаксимальной концентрации NRF2, обеспечивающей максимальный синтез ферментовантиоксидантной системы клетки. Дальнейшее увеличение внутриклеточного уровня H2O2 невызывает АО ответа клетки, что приводит к окислительному стрессу.АБРис. 21. (А) Функционирование генетической регуляции NRF2 сигнальной системы:зависимость концентрации активационного NRF2-MAF ( ) и репрессорного MAF-MAF( ) комплексов, связанных с ARE сайтами DNA. (Б) Регуляторная кривая NRF2 сигнальнойсистемы: зависимость концентрации NRF2 в клетке ()и ядре () отвнутриклеточного уровня H2O2. Точки – экспериментальные данные для 7 клеточных линийрака яичников. Размеры экспериментальных точек пропорциональны величинам скоростиклеточного роста.
На вставках приведены снимки клеточной локализации NRF2,полученные иммунофлуресцентным методом [5].33Приведенные данные для H2O2 концентрации ряда клеточных линий рака яичников наРис. 21Б показывают, что многие раковые клетки (PE01, PE06 и SKOV3) располагаются внеобласти регуляции NRF2-антиоксидантной системы и, предположительно, находятся вусловиях окислительного стресса. Полученные результаты моделирования были проверены вэкспериментах по индуцированию окислительного стресса в раковых клетках, проведенныхколлабораторами проекта в Астон Университете (Великобритания), результаты которых былиопубликованы в совместных работах [3,8,9]. Результаты исследований были также провереныв экспериментах, проведенных коллабораторами проекта в Абертей Университете на 6клеточных линиях рака яичников при действии ингибиторов ErbB2 рецепторов трастузумабаи пертузумаба.
В экспериментах было обнаружено увеличение концентраций H2O2, NRF2 иNRF2-зависимых АО ферментов, что подтверждает результаты теоретических расчетов [5].Таким образом окислительный стресс, вызванный действии ингибиторов ErbB2 рецепторовявляется одним из факторов ингибирующего действия указанных ЛП. Результатыисследований опубликованы в работах [5,6].В Заключении приводятся основные результаты работы и выводы по применениюразработанных компьютерных методов для оценки эффективности лекарственных препаратов,направленных на ингибирование клеточных рецепторов и протеи-киназ в сигнальных путяхраковых клеток с различным набором онкомутаций.Результаты и выводы1. Разработаны методы моделирования сложных сигнальных систем клеточнойпролиферации, позволяющие анализировать изменения динамических режимовфункционирования системы в зависимости от онкомутаций в раковых клетках, а такжеисследовать эффективность действия лекарственных препаратов, направленных наингибирование сигналов, управляющих ростом опухолевых тканей.2.
Развита кинетическая модель активации ERK и PI3K сигнальных путей пролиферации враковых клетках на основе детального описания функционирования отдельныхсигнальных белков, учета регуляторных свойств сигнальной системы и большого набораэкспериментальных данных, полученных на популяциях раковых клеток. Применениемодели для тестирования действия лекарственных препаратов показало эффективностьнового лекарственного препарата, ингибитора ErbB2 и ErbB3 рецепторов (пертузумаба)для подавления активации PI3K сигнального пути в линиях опухолевых клеток яичников.В результате моделирования определен молекулярный биомаркер эффективного действиялекарственных препаратов: соотношение экспрессии рецепторов ErbB3/ErbB2.3.
На основе анализа выходных характеристик сигнальной системы определен управляющийпараметр системы, характеризующий соотношение активностей трех сигнальных белков=PTEN/PI3K/AKT. Показано, что введенный параметр управления является биомаркером,определяющим эффективность ингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов при онкомутациях вPI3K сигнальной системе. Разработанный биомаркер подтвержден в экспериментах наклеточных линиях опухоли яичников и в клинических исследованиях на группе344.5.6.7.8.онкологических пациентах с мутациями PTEN гена.На основе анализа динамических режимов функционирования сигнальной системыпредложена концепция перехода «чувствительность-резистентность», который имеетместо в системе при изменении управляющего параметра и ведет к потеречувствительности системы по отношению к входному сигналу и ингибированиюрецепторных сигналов.Установлено, что возникающая при этом лекарственнаярезистентность обусловлена активацией компенсаторных механизмов в сигнальныхсистемах клетки при мутациях генов PTEN, PIK3CA и AKT.
Предложен метод подавлениярезистентностипутемреализацииобратногоперехода«чувствительностьрезистентность» в результате комбинации двух лекарственных препаратов, действующихна разные модули сигнальной системы.Разработан метод модификации функции отклика сигнальной системы путем измененияпараметра управления системы , что позволило развить метод комбинированногодействия двух лекарственных препаратов для подавления резистентности к ингибиторамклеточных рецепторов при различных онкомутациях. Показано, что ингибированиекиназы PI3K в комбинации с ингибитором клеточных рецепторов восстанавливаетчувствительность PI3K сигнальной системе к действию ингибиторов ErbB3/ErbB2рецепторов при онкомутациях генов PTEN, PIK3CA и AKT. Эффективность комбинацииингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов и PI3K киназы подтверждена в экспериментах наклеточных популяциях опухоли яичников.Развит методов, позволяющий учитывать генетическую регуляцию в кинетическихмоделях сигнальных систем на основе биоинформационного анализа экспериментальныхданных по изменению экспрессии генов при активации сигнальных систем и действиилекарственных препаратов.
Установлен механизм возникновения осцилляторного режимав связанной ERK, AKT сигнальной системе за счет отрицательной обратной связи в ERKсистеме при нарушении генетической регуляцией. Предсказанный в моделиосцилляторный режим подтвержден в экспериментах по наблюдению осцилляций впопуляции раковых клеток.Разработан метод тестирования лекарственных препаратов, ингибиторов протеин-киназ вPI3K сигнальном пути: ингибитора mTOR1 комплекса (рапамицин), ингибитора киназыPI3K и ингибитора двойного действия BEZ-235 для линий клеток опухолей яичников сонкомутациями в сигнальных системах. Установлено, что действие рапамицина приводитк эффективному ингибированию выходного сигнала системы (рS6K1), но вызываетактивацию промежуточного AKT сигнала в результате подавления отрицательныхобратны связей в PI3K сигнальном пути.
Показано, что в исследуемых раковых клеткахактивации AKT является биомаркером эффективного действия рапамицина.Установлено, что для анализа длительного действия лекарственных препаратов,ингибиторовклеточныхрецепторов,необходимоучитыватьмодификацию(репрограммирование) сигнальных систем в результате активации компенсаторныхсигнальных путей клеточной пролиферации при изменении экспрессии генов, вызванныхдействием лекарственных препаратов. Предложена комбинированная терапия дляподавления резистентности системы, возникающей при активации компенсаторных35механизмов клетки в результате репрограммировании сигнальных путей.9. На основе совместного моделирования PI3K сигнальной системы и NRF2-зависимойантиокислительной системы клетки установлено, что действие лекарственных препаратов,ингибиторов ErbB3/ErbB2 рецепторов, приводит к окислительному стрессу, что являетсядополнительным фактором ингибирующего действия указанных ЛП.Публикации автора в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данныхWeb of Science и Scopus, опубликованные по теме диссертации1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
