Автореферат (1097598), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В последнее время исследование петель ООС в сигнальных путяхи их роли в механизмах действуют ЛП становиться важной задачей как при разработке новыхлекарственных препаратов, так и при выборе оптимальной терапии в персонализированной19онкологии.В основе разработанного метода анализа обратных связей в сигнальных системах клеткилежит исследование осцилляторных режимов, возникающих в сигнальных путях при наличииООС, генетической регуляции и взаимосвязей между различными сигнальными путями.Показано, что мутации и действие ЛП, влияющие на силу обратных связей, приводят как квозникновению, так и затуханию осцилляций в сигнальных системах.Результатытеоретических расчетов был апробирован в in vitro экспериментах на MCF-7 линииопухолевых клеток молочной железы, которые проводились коллабораторами проекта вЦентре Исследований Рака Эдинбурского университета [10].
Разработанный методисследования взаимодействия различных подсистем путем анализа возникающихосцилляторных режимов был также применен к исследованию взаимодействия клеток гладкихмышц и эндотелия в сосудистой системе и результаты этих исследований опубликованы вработе [4].Методами компьютерного моделирования были исследованы следующиеотрицательные и положительные обратные связи в PI3K/PTEN/AKT и Ras/MEK/ERKсигнальных путях. При активации ERK пути происходит эффективное ингибированиевходного сигнала системы ее выходным сигналом pERK (Рис. 1).
Молекулярный механизмэтой ООС определяется взаимодействием pERK с адаптерным белком SOS, фактором обменануклеотида для RAS белка, что приводит к фосфорилированию SOS, диссоциации комплексаадаптера SOS-Grb2 и, как следствие, к ингибированию RAS. В кинетической модели ООСpERK-RAS была учтена феноменологически: путем ингибирования активации RAS белкавыходным сигналом pERK. С целью исследования влияния силы ООС pERK-RAS на выходнойсигнал и возникновение осцилляторных режимов в системе в модели была учтена такжегенетическая регуляции RAS/MEK/ERK пути, которая находится под контролем pERK сигнала(Рис. 1).Разработанная модель генетической регуляции описывает pERK-зависимый механизмактивации транскрипционных факторов, которые контролируют экспрессию большого числагенов, находящихся под управлением RAS/MEK/ERK сигнального пути.
В модели учтено, чторяд белков, экспрессируемых при pERK сигнале, формируют обратную связь в этой системе.Так белки DUSP1,2,5, экспрессия которых увеличивается при возрастании концентрацииpERK, являются фосфатазами для ERK киназы и образуют ООС в генетической регуляцииэтого сигнального пути. С целью определения степени и роли данной ООС в регуляцииRAS/MEK/ERK сигнальной системы был проведен биоинформационный анализэкспериментальных данных по экспрессии генов при активации данного сигнального пути врезультате действия HRG в MCF-7 клетках. Эксперименты были выполнены коллабораторамипроекта в Центре Исследования Рака Эдинбурского Университета [10].
На Рис. 10А приведеныэкспериментальные данные для зависимости экспрессии генов на 10, 20 и 40 мин. последобавления 1 нМ HRG в клеточную среду. Согласно полученным данным, экспрессия mRNADUSP1,2, 5 увеличилась в 2-3.5 раза по сравнению с контролем. Эти данные были учтены вкинетической модели генетической регуляции в RAS/MEK/ERK сигнальном пути.На основе полученных результатов по зависимости экспрессии генов от времени былапредложена схема активации ERK киназой факторов транскрипции, регулирующих20экспрессию генов на начальной стадии (IEG, immediate-early gene) и на второй стадии (DEG,delayed-early gene) генетической регуляции. Схема генетической регуляции представлена наРис.
10Б, которая описывает следующие процессы. На начальной стадии ERK киназафосфорилирует фактор транскрипции NF1, Elk-1 (ETS domain-containing protein), в результатечего происходит экспрессия генов начальной стадии регуляции (IEG: FOS, JUN, EGR1) после10-20 мин с начала активации клеток. На второй стадии происходит формирование факторатранскрипции NF2, AP-1 (Activator protein 1), который в качестве субъединиц включаетгетеродимер FOS и JUN.
AP-1 является фактором транскрипции для генов второй стадиирегуляции, которые экспрессируются на 40 мин. На основе проведенного анализа следующиегены были отнесены к DEG группе, экспрессирующийся на второй стадии регуляции:DUSP1,2,5, KLF2, JUNB, ZPF36, DDIT3, CTGF, FOSB, MYC, EGR3 и др. Гены DUSP1,2,5кодируют фосфатазы DUSP1,2,5 (dual-specificityAБBAВCРис.
10. Генетическая регуляция в RAS/MEK/ERK сигнальном пути в MCF-7 клетках ракамолочной железы. (А) – экспериментальные данные по экспрессии 50 генов, полученные на10, 20 и 40 мин. после добавления 1 нМ HRG в клеточную среду. Стрелками показаны mRNAдля DUSP1,2,5 генов. Цвет соответствует изменению экспрессии по сравнению сконтролем в соответствии со шкалой, приведенной справа. (Б) – схема двухступенчатоймодели экспрессии фосфатаз DUSP1,2, 5, включающей раннюю и позднюю экспрессию генов.(В) – теоретическая зависимость экспрессии mRNA DUSP в кинетической модели (3)-(6).Точки - экспериментальные данные [10].phosphatase DUSP-family), которые дефосфорилируют pERK и реализуют отрицательнуюобратную связь в генетической регуляции RAS/MEK/ERK сигнального пути.Разработанная кинетическая модель генетической регуляции соответствуетдвухступенчатому механизму экспрессии фосфатаз DUSP1,2,5 при активации ERK киназы ивключает в себя 4 ОДУ, описывающих кинетику mRNA и экспрессируемых белков:21 dmRNATF 2 R1 F ppERK , TF1 R1 mRNATF 2dt dTF 2 mRNA TF 2E1TF 2E1 dt dmRNADUSP G TF 2 mRNAR2R2DUSPdt dDUSP E 2 mRNADUSP E 2 DUSP dt(3)(4)(5)(6)где mRNATF2 и mRNADUSP – концентрации mRNA генов, кодирующих второйтранскрипционный фактор TF2 и фосфатазу DUSP; функция F(ppERK,TF1) описываетактивацию первого транскрипционного фактора TF1 в результате его фосфорилированияактивной киназой pERK; функция G(TF2) описывает активацию транскрипционного факторTF2; константы αR1 и αR2 - сила промоторов; αR1 и αR2 – скорости трансляции; βRi и βEi – скоростидеградации mRNA и белков, соответственно.
Параметры модели генетической регуляции быливыбраны на основе экспериментальных данных и наилучшего описания кинетики экспрессииmRNA DUSP1,2,5, полученной в экспериментах (Рис. 10В). Кинетическая модельгенетической регуляции (3)-(6) была объединена с моделью RAS/MEK/ERK иPI3K/PTEN/AKT сигнальной системы (1)-(2) с целью исследования взаимодействия двухотрицательных обратных связей: ООС в сигнальной системе ppERK-RAS и генетической ООСpERK-DUSP.Исследование кинетики pERK в модели показало, что благодаря ООС изменениеконцентрации экспрессируемой фосфатазы DUSP существенно влияет концентрацию pERK.При выбранных параметрах объединенной модели в сигнальной системе наблюдаетсяпостоянный сигнал pERK с маловыраженными затухающими колебаниями (Рис.
11А, тонкаясплошная линия). В этом случае RAS/MEK/ERK сигнальный путь находится под контролемдвух связанных ООС, причем генетическая ООС модулирует ООС в сигнальной системе. Причастичном ингибировании генетической обратной связи в результате уменьшения уровняэкспрессии фосфатазы DUSP в системе наблюдались затухающие колебания (Рис. 11А,толстая сплошная линия). В этом случае уменьшение силы генетической ООС ведет квозрастанию силы ООС в сигнальной системе и увеличению выходного сигнала pERK. Приполном отключении генетической ООС в системе происходила бифуркация режимафункционирования с возникновением незатухающих колебаний pERK сигнала с периодом 20мин. (Рис.
11А, пунктирная линия). Установлено, что дополнительным механизмоввозникновения колебаний в модели, помимо подавления генетической ООС, являетсянелинейный характер функции ингибирования киназы RAS выходным сигналом pERK. Вмодели функция, описывающая ООС в сигнальной системе, характеризуется параметромХилла n = 3. Предполагается, что нелинейность ООС определяется сложным характеромкинетики каскада реакций, включающего фосфорилирование SOS, диссоциации комплексаGrb2-SOS с последующей диссоциацией SOS от рецептора.22Рис. 12. Результаты теоретических расчетов осцилляторных режимов в связаннойPI3K/PTEN/AKT, RAS/MEK/ERK сигнальной сети в клетках MCF-7 и MCF-7/HER2 ракамолочной железы. (A) – осцилляции pERK сигнала при различных величинах обратнойгенетичеcкой связи: при включенной генетической связи (тонкая сплошная линия, αR1); при50% ингибировании генетической связи (толстая сплошная линия, 0.5α R1) и при полномингибировании генетической связи (пунктирная линия, α R1=0).
(B) - осцилляции pAKT привключенной генетической связи (сплошная линия) и при полном ее ингибировании(пунктирная линия). (С) и (D) – соответственно, осцилляции pERK и pAKT в клетках MCF7/HER2 с повышенной экспрессией HER2 рецептора (сплошные линии) и подавление pERKи pAKT осцилляций при действии 100 нМ пертузумаба, 2С4, (пунктирные линии).С целью экспериментального исследования взаимодействия двух ООС и ролигенетической регуляции в RAS/MEK/ERK сигнальном пути в Центре Исследования РакаЭдинбурского Университета был проведен эксперимент по блокировке генетической ООСингибитором транскрипции циклогексимидом (10 μМ CXH) в клеточной линии рака молочнойжелезы MCF-7.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
