Автореферат (1097598), страница 7
Текст из файла (страница 7)
В экспериментах были обнаружены осцилляции pERK с периодом 20 мин (Рис.12), что согласуется с результатами теоретических расчетов (Рис. 12А). Также в экспериментахна MCF-7 клетках, обработанных CXH, были обнаружены колебания pAKT сигнала спериодом близким к 20 мин (Рис. 12). Синхронизация между осцилляциями pAKT и pERKуказывает на существование связи между RAS/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальнымипутями.
Для описания этой взаимосвязи в модели было учтено взаимодействие киназ RAS иPI3K, приводящее к дополнительной активации PI3K киназы (Рис. 1). В результате учета этойсвязи модель воспроизводит осцилляции pAKT сигнала, индуцированные колебаниями pERK,в исходных клетках и усиление колебаний в клетках, обработанных ингибиторомтранскрипции CXH (Рис. 11B).Результаты компьютерных расчетов также показали, что связанные pAKT/pERKосцилляций возникают в системе при повышенном входном сигнале, который формируетсяпри активации рецепторов (Рис. 11C,D, сплошные линии). Установлено, что ингибированиерецепторного сигнала пертузумабом приводит к подавлению осцилляций в системе (Рис.2311C,D, пунктирные линии). С целью экспериментального исследования этого эффекта былипроведены эксперименты на MCF-7/HER2 клетках с повышенной экспрессией HER2рецепторов (клетки трансфецированные HER2 геном). В экспериментах были обнаруженыколебания pERK и pAKT сигналов (Рис.
12B, черные линии), а также подавление колебанийпри действии ингибитора HER2 рецептора, петрузумаба (Рис. 12B, серые линии)Рис. 13. Экспериментальное наблюдение осцилляторных режимов в связаннойPI3K/PTEN/AKT, RAS/MEK/ERK сигнальной сети в MCF-7 и MCF-7/HER2 линиях опухолевыхклеток молочной железы. (A) - экспериментальные данные для pERK (слева) и pAKT (справа)сигналов (черные линии) и осцилляции pERK и pAKT при действии ингибитора транскрипции10 мкМ CXH (серые линии).
(B) pERK (слева) и pAKT (справа) осцилляции в клетках MCF7/HER2 с повышенной экспрессией HER2 рецепторов в отсутствие (черные линии) и вприсутствии 100 нМ пертузумаба, 2С4 (серые линии). Экспериментальные точки полученыв результате оцифровки данных Вестерн-блоттинг анализа для pERK (T202/Y204) и pAKT(S473) в клетках при их активации 1 нМ HRG [10].Таким образом, активация связанных pAKT/pERK осцилляций подтверждаетсуществование положительной связи между RAS/MEK/ERK и PI3K/PTEN/AKT сигнальнымипутями в MCF-7 опухолевых клетках.
Активационный характер колебаний при нарушениигенетической регуляции указывает на роль генетической ООС в подавлении осцилляторныхрежимов в этих сигнальных путях при их активации.В пятой главе представлены результаты по исследованию механизмоврепрограммирования сигнальных систем в результате действия антираковых лекарственныхпрепаратов. В процессе репрограммирования сигнальных системах происходит активациядополнительных сигнальных путей пролиферации раковых клеток, что приводит ккомпенсации ингибирующего действия лекарственных препаратов и тем самым крезистентности к их действию. Компенсаторные сигнальных путей клетки активируются,главным образом, за счет экспрессии генов, находящихся под управлением сигнальной24системы, которая является мишенью данного лекарственного препарата.
В работепредполагалось, что наблюдаемые изменения экспрессии генов при лекарственной терапиимогут быть происходить в результате активации адаптационного ответа клетки налекарственную интервенцию. Исследование подобных компенсаторных механизмов являетсяважной задачей при исследовании приобретенной резистентности к новым ЛП ивозникновения побочных эффектов при их применении.Механизм репрограммирования сигнальных систем был исследован на клеточнойлинии SKOV3 опухоли яичников с высоким уровнем экспрессии ErbB3 (HER2) рецепторовпри действии лекарственных препаратов трастузумаба, пертузумаба и их комбинации.Разработанная модель сигнальных путей применена к анализу in vivo экспериментальныхданных, полученных коллабораторами проекта на опухолях SKOV3 ксенотрансплантатныхмышей.
Измерение объема трансплантатной опухоли в течении 35 дней показало, чтопертузумаб оказывает слабый ингибирующий эффект, трастузумаб существенно замедляетрост опухоли в течении 2 недель, после чего рост возобновляется в то время, как комбинациятрастузумаба и пертузумаба вызывает полную регрессию опухоли (Рис. 14А).Для описания полученных экспериментальных данных было проведено исследованиеответа генетической регуляции клетки на лекарственную терапию. С этой целью проведенстатистический анализ экспрессии генов при действии трастузумаба, пертузумаба и ихкомбинации в экспериментах на SKOV3 опухоли ксенотрансплантатных мышей.Результаты статистического анализа более 12000 транскрипт представлены на Рис.
14Б,где приведены уровни экспрессии для генов со статистически значимым изменениемэкспрессии (р<0.05) по сравнению с контролем при действии пертузумаба, трастузумаба и ихкомбинации. Результаты статистического анализа также представлены в виде диаграмм наРис.14В-Д, на которых приведены уровни экспрессии генов по оси ординат (log2) и р-значенияпо оси абсцисс. Из полученных данных видно, что ЛП и их комбинация по-разному влияют наэкспрессию генов.
Обнаружено увеличение экспрессия гена ErbB3 в 2 и 1.3 раз при действиикомбинации ЛП, и трастузумаба, соответственно. Механизм возрастания экспрессии генаErbB3 при ингибировании pAKT и pERK сигналов заключается в активации фактортранскрипции FOXO, под контролем которого находится экспрессии гена ErbB3.В модели учтено, что повышенная концентрации ErbB2 рецепторов в клетках SKOV3приводит к спонтанной гомодимеризации ErbB2 рецепторов и активации сигнальных путей вотсутствии рецепторных лигандов. Полученные результаты моделирования показали, чтоингибирующее действия трастузумаба, пертузумаба и их комбинации на уровни pAKT и pERKсигналов существенно зависят от отношения концентраций ErbB3 и ErbB2 рецепторов в клетке,ErbB3/ ErbB2 (Рис.
15). Как показали расчеты, при низком соотношении ErbB3/ErbB2(высокий уровень ErbB2 рецепторов) трастузумаб оказывает существенное ингибирующеедействие на pERK сигнал за счет ингибирования лиганд-независимой гомодимеризацииErbB2/ErbB2 рецепторов (Рис. 15А). При возрастании экспрессии ErbB3 рецепторов егодействие на pERK сигнал ослабевает за счет активации сигнала, формирующегося приErbB3/ErbB2 гетеродимеризации. Также в расчетах было выявлено отсутствие действиятрастузумаба на pAKT сигнал. Этот эффект связан со слабой активацией PI3K/AKTсигнального пути по сравнению с активацией RAS/MEK/ERK пути при гомодимеризации25AВDБAГEДРис.
14. (А) Экспериментальные данные по действию трастузумаба, пертузумаба и ихкомбинации на рост опухоли SKOV3 ксенотрансплантатной мыши. (Б) Результатыстатистического анализа экспрессия генов при действии лекарств и их комбинации.Приведены гены со статистически значимым изменением экспрессии (log2) по сравнению сконтролем. (В)-(Д) Экспрессия генов в результате действия трастузумаба (В),пертузумаба (Г) и их комбинации (Д) в образцах опухоли. Результаты измерений уровнейmRNA представлены в виде диаграмм «уровень экспрессии (log2) – р-значение».ErbB2/ErbB2 рецепторов в SKOV3 клетках, что обусловлено отсутствием фосфо-сайтовErbB2 рецепторов для прямого связывания и активации p85 сигнальной субъединицы PI3K.Активация pAKT сигнала в модели происходит в основном за счет гетеродимеризацииErbB3/ErbB2 рецепторов и фосфорилирования фосфо-сайтов ErbB3, являющихся местамисвязывания p85 субъединицу PI3K.На основе проведенных расчетов исследован механизм синергетического действиякомбинации трастузумаба и пертузумаба при ингибировании роста SKOV3 опухоли посравнению с их действием в отдельности.
Показано, что комбинация двух ЛП проявляетвысокую эффективность по отношению к ингибированию pERK как при высокой экспрессии26Рис. 15. Результаты расчетов ингибирующего действия трастузумаба (A), пертузумаба (B)и их комбинации (C) на уровни pAKT (красные линии) и pERK (черные линии) сигналов взависимости от отношения концентраций HER3 (ErbB3) и HER2 (ErbB2) рецепторов вклетке HER3/HER2.ErbB2 рецепторов (низкое отношение ErbB3/ErbB2), так и при повышенной экспрессии ErbB3рецепторов (HER3/HER20.6).
В отличии от действия комбинации ЛП пертузумаб проявляетслабую активность на начальной стадии роста SKOV3 опухоли, клетки которой имеютповышенную экспрессии ErbB2 рецепторов. Его эффективность повышается при возрастанииэкспрессии ErbB3 рецепторов, вызванной действием ЛП. В свою очередь, трастузумабпроявляет высокую эффективность при повышенной экспрессии ErbB2 рецепторов в началероста опухоли и теряет свою эффективность при возрастании экспрессии ErbB3 рецепторов врезультате действия ЛП.Таким образом, комбинация трастузумаба и пертузумаба проявляет высокуюактивность как при повышенной экспрессии ErbB2 рецепторов, которая наблюдается в началероста опухоли, так и при возрастании концентрации ErbB3 рецепторов, вызваннойрепрограммированием сигнальной системы при длительном действии ЛП [20].Чтобы показать, что трастузумаб и пертузумаб проявляют ингибирующий эффект наразных стадиях роста опухоли, в работе было проведено сравнение теоретических расчетов сin vitro экспериментальными данными, измеренными на клеточных популяциях в течении 1часа, когда в клетках не наблюдается сильного изменения экспрессии рецепторов (Рис.
16).Для сравнения были выбраны клетки MCF7 c соотношением HER3/HER21 и MCF7-HER2-18клетки c повышенной экспрессией HER2 рецепторов (клетки трансфецированные HER2геном). Результаты сравнения показали, что пертузумаб эффективен в MCF7 клетках ипроявляет слабое ингибирующее действие для MCF7-HER2-18 клеток, в то время кактрастузумаб проявляет ингибирующую активность в MCF7-HER2-18 клетках и малоэффективен для MCF7 клеток (Рис. 16).Таким образом, в работе установлено, что синергетическое действие комбинациилекарственных препаратов трастузумаба и пертузумаба на ингибирование роста опухоли,образованной клеточной линией SKOV3 рака яичников с повышенной экспрессией ErbB2рецепторов, обусловлено эффективным ингибированием pERK сигнала пролиферации клетокпри изменении экспрессии ErbB3 рецептора в результате репрограммирования сигнальнойсистемы, индуцированного длительным действием лекарственных препаратов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
