Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Поточная схема трехбуферной системы для ренатурации на ионообменнике (1. Колонна снанесенным образцом, уравновешенная подвижной фазой, включающей 8 М мочевины; 2. Понижениеконцентрации мочевины и градиентное повышение ионной силы подвижной фазы; 3. Элюция белкапо колонне, начало ренатурации белка на колонне; 4.
Десорбция ренатурированного белка с колонныза счет высокой ионной силы подвижной фазы).При ренатурации белков, содержащих дисульфидные связи, ключевым фактором является также значение рН ренатурирующего буферного раствора[114]. Для разных белков оптимальные значения рН различны. Обычно агре‑гация затруднена при значениях рН, далеких от изоэлектрической точки белка [115].
Для ускорения тиол-дисульфидного обмена следует по возможности‑проводить ренатурацию при слабощелочных значения рН.Альтернативой ренатурации при обратимой адсорбции служит использованиековалентно присоединенных белков, которые облегчают фолдинг белка, аименно шаперонов и антител.F44Кинетика фолдинга и агрегации in vivo регулируется шаперонами и фолдазами [116]. Шапероны GroEL и GroES из E.coli могут связывать полипептид и/‑или интермедиаты их фолдинга, предотвращая неправильные взаимодействияполипептидных цепей, приводящие к агрегации.
Неудивительно, что эти белки оказывают влияние и на in vitro ренатурацию и агрегацию [117]. Посколь‑ку шапероны и фолдазы необходимо удалять из раствора ренатурированногоцелевого белка, и сами по себе они достаточно дороги, то возникает необходимость разработки схемы с рециклом. Например, при ренатурации лизоцимауспешно зарекомендовал себя GroEL, иммобилизованный на агарозном геле[118]. Для ренатурации восстановленного токсина скорпиона Cn5 применяли‑трехкомпонентную шаперонную систему: GroEL минишаперон (предотвращает агрегацию белка), DsbA (катализирует образование дисульфидных связей) и пептидилпролилизомераза [119].
Иммобилизированные шапероны мо‑гут быть использованы неоднократно, что значительно снижает себестоимость процесса.Показано, что антитела облегчают рефолдинг антигена целевого белка, причем антитела только против нативного антигена целевого белка [120]. Если‑антитела могут сохранять или восстанавливать свое сродство к антигену приразумно высоких концентрациях денатуранта, то при ренатурации антигеновможно использовать иммобилизованные антитела, что особенно актуальнодля промышленных процессов.К сожалению, на основе только структурных и физико-химических характеристик отдельно взятого белка невозможно заранее точно определить подходящий способ проведения ренатурации.
Поэтому оптимальная процедура ренатурации подбирается на основе экспериментальных данных.Особые проблемы могут возникнуть при ренатурации белков, имеющих в составе своей последовательности остатки цистеинов, образующие дисульфидные мостики.Во время in vitro ренатурации таких белков наряду с ковалентными дисульфидными связями могут образовываться фрагменты с нековалентной вторичной, третичной и даже четвертичной структурами.
Число возможных комби-F45наций резко возрастает при увеличении количества остатков цистеина в полипептидной цепи [121]. Статистически, чрезвычайно низкий выход пра‑вильно свернутого белка обуславливается случайным замыканием многочисленных дисульфидных связей. Однако в природе образование правильныхдисульфидных связей в белке облегчается за счет термодинамических равновесий и свободной энергии.Окисление остатков цистеина во время образование дисульфидных связейбыло впервые осуществено при помощи молекулярного кислорода [122].‑Хотя окисление воздухом может быть катализировано добавлением 1мкМCu2+ в ренатурирующий буфер [123], скорость образования и выход правильно-замкнутых дисульфидных связей в большинстве случаев крайне низки.Из-за низкой эффективности образования дисульфидных связей при окислении молекулярным кислородом очень часто применяются реакции тиол-дисульфидного обмена в присутствии низкомолекулярных тиолов в восстановленном и окисленном состояниях.
Наиболее часто в качестве «оксидо-смешивающего» реагента используется восстановленный и окисленный глутатион(GSH и GSSG соответственно). Для некоторых белков наиболее подходящимиявляются такие окислительно-восстановительные пары, как цистеин/цистин,цистеамин/цистамин, ди-β-гидроксиэтил-дисульфид / β-меркаптоэтанол. Поскольку тиол-дисульфидный обмен заключается в нуклеофильной атаке тиолатного аниона, то наиболее блаоприятными условиями реакции являетсяслабощелочная среда.Реакции тиол-дисульфидного обмена быстро-обратимые, поэтому «оксидосмешивающие» увеличивают как скорость образования, так и выход белков справильно замкнутыми дисульфидными связями из-за быстрого окисленияошибочных дисульфидных связей.
Для большинства белков оптимальнымиусловиями является присутствие в ренатурирующем растворе восстановленной формы низкомолекулярного тиола в концентрации 1-3 мМ и окисленнойформы в концентрации примерно в 5-10 раз выше [124].‑При ренатурации in vitro сопутствующее образование дисульфидных связейзачастую осложняется из-за низкой растворимости восстановленных, денату-F46рированных полипептидных цепей, что может привести к массовой агрегации на ранних этапах ренатурации. В этом случае образование смешанныхдисульфидов с тиольными реагентами снижает вероятность протекания конкурирующих реакций агрегации. Во время образования смешанных дисульфидов (например, с глутатионом) в полипептидную цепь вовлекается большое количество заряженных остатков – именно это препятствует агрегациина ранних этапах ренатурации.
Во время in vitro ренатурации человеческогоплазминогенного активатора из тел включения E.coli, который в нативнойформе содержит 17 дисульфидных связей, выход целевого белка был значительно увеличен при образовании смешанных дисульфидов с глутатионом[125]. При ренатурации через смешанные дисульфиды сначала происходит‑модификация денатурированных восстановленных полипептидных цепей приизбытке окисленной формы низкомолекулярного тиола.
Во время последующего шага ренатурации образование правильных дисульфидных связей катализируется добавлением следовых количеств восстановленной формы соответствующего тиола.Кроме методики смешанных дисульфидов для улучшения ренатурации белков с дисульфидными связями используется метод S-сульфонатов [126]. Ранее‑были проведены исследования по сравнению данных методик для различныхбелков, например для катепсина В [127].‑Какие же факторы имеют непосредственное влияние на протекание ренатурации?Наиболее важным физическим фактором, влияющим на ренатурацию белков,является температура [128, 129]. Температура оказывает двойной эффект на‑‑ренатурацию.
С одной стороны, она влияет на скорость рефолдинга, а с другой – на склонность итнермедиатов фолдинга образовывать агрегаты. Тем неменее, существует некоторый температурный диапазон, в котором каждыйотдельный белок термодинамически стабилен в определенной буферной системе [130]. Как правило, при пониженной температуре ренатурации преоб‑ладают реакции правильного сворачивания белка, в то время как реакции агрегации подавляются. Однако низкие температуры приводят к снижениюF47скорости ренатурации и увеличению времени, необходимого для образованиянативной структуры белка.
Для большинства белков опыты по подбору оптимальной температуры ренатурации начинаются с 15°С.Давление также считается важным физическим фактором, влияющим как наструктуры белка, так и на его ренатурацию. Показано, что давление выше3 кбар может разрушать олигомерные белковые структуры [131] и растворять‑белковые агрегаты и ТВ [132, 133].
Мономеры белка сохраняют нативную‑‑вторичную структуру до давления 5 кбар. После постепенного спада давления до нормального они могут принимать нативную конформацию даже привысоких концентрациях белка, т.к. агрегаты белка не могут образовыватьсяпри повышенном давлении [134].‑При протекании корректной ренатурации существенными факторами являются также компоненты буферного раствора и простетические группы.Неденатурирующие концентрации хаотропных агентов в большинстве случаев оказывают положительное влияние на эффективность ренатурации [135].‑Например, ренатурация восстановленного химотрипсина А с сопутствующимобразованием дисульфидных связей осуществима только в присутствии неденатурирующих количеств мочевины или гуанидин-гидрохлорида [136].‑Однако, неденатурирующие концентрации этих добавок могут оказывать отрицательный эффект на ренатурацию в случаях, когда образующиеся интермедиаты рефолдинга склонны к агрегации.
Кроме мочевины и гуанидин-гидрохлорида для повышения эффективности ренатурации используют и другиехаотропные агенты (алкил-мочевина) или органические соединения типаамидов карбоновых кислот.При исследовании ренатурации лизоцима в присутствии гуанидин-гидрохлорида [137]обнаружено, что максимальный выход ренатурированного белка‑обеспечивается при концентрации хаотропного агента около 1,5 М и превышает 60 %. При концентрации гуанидин-гидрохлорида ниже 1 М наблюдается образование агрегатов лизоцима сразу же после разбавления в ренатурирующем буфере.
При концентрациях гуанидин-гидрохлорида выше 1,5 Мэффективность ренатурации снижалась, т.к. происходила денатурация натив-F48ного лизоцима. В ходе данных исследований был проведен широкий скрининг различных добавок. Наиболее хорошие результаты получены при использовании ацетона и ацетамида. При этом необходимая концентрация гуанидин-гидрохлорида составила всего около 0.7 М, т.к.
и ацетон, и ацетамидтакже играют важную роль в предотвращении агрегации лизоцима.Все добавки могут быть разделены на 2 группы (Таблица 4):а) облегчающие фолдинг;б) подавляющие агрегацию.В то время как добавки из первой группы облегчают белок-белковые взаимодействия, из второй - препятствуют взаимодействию между полипептиднымицепями, снижая ассоциацию интермедиатов ренатурации. Последнее утверждение справедливо для полиэтиленгликоля (ПЭГ) [138], циклодекстрина‑[139], L-аргинин/HCl [140, 141, 142, 143], полиаминов (путресцин, сперми‑‑‑‑‑дин, спермин) [144, 145] и аминокислот (пролин, лизин) [146, 147]. ПЭГ и‑‑‑‑циклодекстрин связываются с гидрофобными регионами интермедиатов.
Обнаружено, что стехиометрические количества полиэтиленгликоля облегчаютправильную пространственную укладку карбоангидразы В при ренатурации[148]. В данном случае ПЭГ ингибирует агрегацию из-за образования слож‑ных комплексов с глобулами интермедиатов, которые в противном случаесклонны к агрегации.Таблица 4.
Классификация низкомолекулярных добавок.Тип добавкиПримерОблегчающаяфолдингСахарозаСульфат аммонияПодавляющаяагрегациюПЭГЦиклодекстринполиаминыL-аргинин/HClСлабые детергентыВлияние настабильностьбелкаВлияние на белокбелковыевзаимодействияСтабилизируютОблегчаютНейтральныПодавляютF49ДенатурантыМочевинаГуанидингидрохлоридСильные детергентыДестабилизируютПодавляютНаиболее часто в качестве низкомолекулярной добавки используется L-аргинин/HCl, хотя до сих пор точно не ясно его влияние на стабильность белков.Хотя аргинин содержит гуанидинную группу, он не дестабилизирует нативную структуру белка в такой степени, как гуанидин-гидрохлорид.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
