Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Связывание окисленного лизоцима с мочевиной и гуанидин-гидрохлоридом.В случае белков, содержащих цистеин, выделенные ТВ обычно содержат некоторое количество межмолекулярных дисульфидных связей [74], которые‑снижают растворимость ТВ в отсутствии восстанавливающих агентов, такихкак дитиотреитол (ДТТ), дитиоэритритол, глутатион, цистеин, цистамин илиβ-меркаптоэтанол.
Добавление этих низкомолекулярных тиольных реагентовв комбинации с хаотропными агентами приводит к восстановлению межмолекулярных дисульфидных связей (реакция тиол-дисульфидного обмена).Поскольку активной частицей при тиол-дисульфидном обмене является тиолатный анион, растворение ТВ в присутствии восстанавливающего агентаследует проводить в слабощелочных условиях.Восстановление инсулиноподобного фактора роста I в периплазматическомпространстве E.coli приводит к образованию как нативного, так и агрегированного белка [75]. В этом случае, эффективное выделение белка в денатури‑F33рованной форме было достигнуто in situ при растворении белка непосредственно из культуральной среды в присутствии мочевины и восстанавливающего агента.
В последствии денатурированный белок был выделен двух-фазовой жидкостной экстракцией.ТВ, выделенные после максимального разрушения клеток, обычно относительно гомогенные. В этом случае белки могут быть ренатурированы непосредственно после растворения без предварительной очистки растворенного,денатурированного белка. Считается, что в подобных условиях ренатурацияцелевого компонента и примесных полипептидов не является взаимозависимой и поэтому нет необходимости проводить предварительную очистку выделенного из ТВ и денатурированного целевого рекомбинантного белка [76].‑Однако по другим данным [71], растворенные ТВ содержат различные примеси, которые могут ассоциироваться с целевыми белками и взаимодействовать с ними во время ренатурации, значительно ухудшая ее результат.
Былипроведены опыты по искусственному внесению примесей в раствор ТВ лизоцима яичного белка с последующей ренатурацией [77]. При искусственном‑добавлении плазмидных ДНК, липополисахаридов и некоторых белков наблюдалось значительное увеличение степени агрегации и, соответственно,снижение выхода ренатурирированного лизоцима. При изучении ренатурациирекомбинантного человеческого фактора стимуляции колоний макрофагов(ГМ-КСФ) выход ренатурации существенно увеличился после предварительной очистки денатурированного восстановленного белка при помощи ОФВЭЖХ [78].‑Необходимо проводить предварительную очистку белка в том случае, еслицелевой белок составляет меньше 2-5% общего белка клеток или меньше 2/3общего белка ТВ [79].‑В любом случае при использовании спектральных методов(флюоресценция,круговой дихроизм) для контроля ренатурации, необходима предварительнаяочистка растворенного белка ТВ для получения корректных данных.
Очисткуможно проводить при помощи ОФ-ВЭЖХ, гель-фильтрации или ионообменной хроматографии в присутствии денатурирующего агента. Если целевойF34белок имеет в своем составе полигистидиновый таг, то такой белок можетбыть очищен при помощи металл-хелатной хроматографии в присутствиивысоких концентраций денатурирующего агента [80]. В этом случае необхо‑димо тщательно удалять следовые количества металлов в элюате или добавлять ЭДТА в элюат для образования комплексов с металлами. В противномслучае даже следовые количества металлов приводят к окислению остатковцистеина во время последующей ренатурации.Все за и против предварительной очистки белка перед ренатурацией необходимо тщательно оценивать, т.к. они обусловливают потенциальную потерюбелка и увеличение себестоимости.2.2. Ренатурация и рефолдингВ основном, методы, используемые для растворения ТВ, приводят к образованию раствора белка в денатурированном состоянии.
Для образования нативной структуры белок должен быть «перенесен» в благоприятные для этогоусловия (например, низкие концентрации денатуранта). При благоприятныхусловиях ренатурация может занимать от нескольких секунд до несколькихдней. Во время ренатурации in vitro наряду с «правильным» сворачиваниеммолекулы белка протекают нежелательные процессы агрегации и «неправильного» сворачивания (мисфолдинг). Общая схема ренатурации белков телвключения представлена ниже (Рисунок 6).Агрегация может быть обусловлена как неспецифическими (гидрофобными)взаимодействиями между развернутыми полипептидными цепями, так и некорректными взаимодействиями частично свернутых интермедиатов фолдинга. Эти процессы являются реакциями второго и более высоких порядков, вто время как «правильная» ренатурация – реакция первого порядка.
Вследствие этого при увеличении концентрации денатурированного белка наблюдается увеличение скорости реакций агрегации, которые становятся преобладающими.F35FРисунок 6. Фолдинг и агрегация во время ренатурации белка (Процесс ренатурации в нативное состояние (1) конкурирует с процессами мисфолдинга (2) и агрегации (3).Синие линии – гидрофильныеучастки белка; красные линии – гидрофобные участки белка).Поэтому предотвращение гидрофобных межмолекулярных взаимодействий впервые моменты ренатурации является определяющим фактором при высоких концентрациях белка.Ренатурация рекомбинантных белков обычно проводится диализом или разбавлением [81, 82, 83]. Во время диализа денатурированный белок достаточ‑‑‑но длительный промежуток времени находится в растворе, при этом концентрация денатурирующего агента снижается постепенно [84, 85].
Скорость об‑‑разования интермедиатов, а затем и ренатурированного белка в нативном состоянии увеличивается по мере снижения концентрации денатуранта. Однакопри этом увеличиваются также скорости агрегации и мисфолдинга. В частности, агрегация усиливается при невысокой скорости фолдинга, т.к. низкие ипромежуточные концентрации денатуранта могут быть недостаточны дляподдержания интермедиатов в растворенном состоянии. Кроме того, при диализе или диафильтрации [86] выход ренатурации может снижаться при не‑специфической адсорбции белка на ультрафильтрационных мембранах.
Некоторые денатурированные полипептиды могут также проникать через мембрану в буферный раствор. Поэтому для некоторых белков этот метод неприменим [87].‑F36Прямое разбавление является наиболее простой процедурой ренатурации,позволяющей избежать промежуточных концентраций денатуранта. Чащевсего финальная концентрация белка после разбавления составляет 1-10 мкг/мл для обеспечения благоприятных условий ренатурации и предотвращенияагрегаций. Эта методика широко применяется в лабораторных условиях [88,‑89, 90]. В некоторых случаях происходит резкое осаждение рекомбинантного‑‑белка при быстром разбавлении в ренатурирующем буферном растворе.
Тогдапостепенное удаление денатуранта при диализе является единственным способом ренатурации. В промышленном масштабе ренатурация методом разбавления редко используется из-за длительности проведения и большого количества буферных растворов [26], причем после ренатурации необходимадополнительная стадия концентрирования.Кроме диализа и быстрого разбавления для ренатурации белков ТВ такжеуспешно используется пошаговое разбавление. Данный метод, названный«пульсовой» ренатурацией, позволяет на 10% увеличить выход ренатурированного белка по сравнению с обычным разбавлением [91] и применяется в‑том случае, когда необходимо обеспечить высокую финальную концентрациюренатурированного белка.
Впервые данная методика была описана Винтер[92] для рекомбинантного белка His8–Arg-проинсулина и заключалась в 30‑кратном внесении 0,5 мг/мл белка в ренатурирующий буфер каждые 30 мин.При этом белок в каждой последующей внесенной порции успевал ренатурировать на 60 %. Таким образом, через 15 ч от начала ренатурации ученымудалось получить раствор ренатурированного белка с финальной концентрацией выше 6 мг/мл. Однако для применения этого метода необходимо обладать обширными знаниями в кинетике ренатурации необходимого белка, поскольку оптимальным считается добавление следующей порции денатурированного белка только после того, как будет достигнут 80 % (от теоретического) выход уже ренатурированного белка [93].‑В последнее время большое внимание уделяется ренатурации при помощихроматографических методик.F37Ренатурация с использованием хроматографических процессов является особенно привлекательной из-за доступности коммерческих препаративныххроматографических систем.
Кроме того, она зачастую может сопровождаться одновременной частичной очисткой [90]. Существуют три принципиальноразличные подходы хроматографической ренатурации:1. Буферный обмен при помощи эксклюзионной хроматографии (SEC);2. Обратимая адсорбция денатурированного белка на матрице с последующим удалением денатуранта для ускорения ренатурации;3. Иммобилизация катализатора фолдинга на хроматографической подложке.Ниже суммированы основные типы хроматографических методик ренатурации (Таблица 3).
Не существует единственного универсального метода, который был бы применим для ренатурации всех белков. Для разработки схемы,идеально подходящей для ренатурации отдельно взятого белка, необходимопровести значительное количество экспериментов по оптимизации типовыхсхем ренатурации.Как известно, основной причиной низкого выхода процесса ренатурации является образование агрегатов при высоких концентрациях белка. При помощи SEC можно ограничить объем пор в геле, доступный для различных формбелка, что облегчает разделение правильно свернутого белка и его агрегатов.Впервые метод SEC успешно использовался для подобных целей в 1981 годуАмонсом и Шриером [94] для удаления SDS из раствора денатурированного‑белка, а первое его применение непосредственно для проведения ренатурации белка относиться к 1994 году [95].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
