Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Батасом и коллегами [96] была прове‑‑дена ренатурация лизоцима и карбоангидразы при крайне высоких начальныхконцентрациях белка (выше 80 мг/мл) на колонне, упакованной SephacrylS-100. При этом выход лизоцима составил 63 % со средней специфическойактивностью 104 %, для карбоангидразы эти цифры составляли 56 % и 81 %соответственно.F38Таблица 3. Примеры типичных схем ренатурации при помощи хроматографии.ТипренатурацииБуферныйобмен припомощи SECБуферныйобмен припомощиадсорбционнойхроматографииИммобилизированныекатализаторыфолдингаТипхроматографииТип элюцииНормальнаяSECНормальная SECГрадиентнаяSECБез градиентаГрадиентмочевиныГрадиентмочевины и рНБелокВыход,%RETS-1 изоформа PDGF 75ScFv14,517,325ТрехбуфернаясистемаДвухбуфернаясистеманекоторые ТВлизоцим человекане опр.40IMACТрехбуфернаясистемаHis-TNF90HICНормальная HICα-интерферон человекане опр.RPCНормальная RPCИнтерлейкин-2 человека не опр.GroEL, GroESСмесь денат.белковлизоцимЛипосомыНормальнаяэлюциялизоцим90PEGНормальнаяэлюциялизоцим90IEC85Сокращения: SEC – эксклюзионная хроматография, IEC – ионообменная хроматография,IMAC – металлхелатная хроматография, HIC – хроматография гидрофобныхвзаимодействий, RPC – обращено-фазовая хроматография, PDGF – тромбоцитарныйфактор роста, ScFv – одноцепочечный фрагмент Fv, TNF – фактор некроза опухолей.Успешная ренатурация при помощи SEC зависит от двух ключевых факторов[97].
Первый заключается в нанесении раствора белка на хроматографиче‑скую колонну в присутствии денатуранта. Второй фактор заключается в изменении размера белка при ренатурации во время элюции ренатурирующимбуферным раствором. Действительно, в процессе хроматографической ренатурации имеет место изменение размера радиуса Стокса, гидродинамическо-F39го объема и коэффициента распределения [98]. Было также исследовано вли‑яние типа геля на выход ренатурации [99]. Обнаружено, что в ряду гелевых‑матриц от Sephacryl S-100 до S-400 наблюдается снижение степени агрегации, однако разделение между ренатурированным белком и денатурантомснижается. При использовании колонны, упакованной Sephacryl S-300, былполучен оптимальный выход ренатурации фрагмента плазминогенного активатора урокиназы (М = 45 кДа), который составил более 60 %.Гу с коллегами [100] внедрили новую концепцию SEC-ренатурации, основан‑ную на понижающемся градиенте мочевины, что обеспечивает благоприятные, легко контролируемые условия ренатурации (Рисунок 7).
Данная методика позволяет избежать резкого изменения концентрации мочевины. Ключевыми параметрами такой методики ренатурации являются градиент концентрации денатуранта и скорость элюции.FРисунок 7. Поточная схема SEC-ренатурации в градиенте мочевины (1. Колонна, уравновешенная ренатурационным буфером. Верхняя часть колонны – область градиента мочевины; 2.
Нанесение образца, растворенного в 8М мочевине. При элюции образца происходит одновременное продвижениеобласти градиента мочевины по нисходящей линии; 3. Однако белок двигается вниз по колонне быстрее, чем градиент мочевины; 4. В конце колонны белок попадает в область, лишенную мочевины, иэлюируется с колонны в ренатурированном состоянии).Эта методика в дальнейшем была усовершенствована [101] дополнительным‑градиентом рН.F40На первый взгляд кажется, что линейный градиент денатуранта применимпрактически во всех случаях. Однако некоторые белки могут быть нестабильны при определенных концентрациях денатуранта. Таким образом, необходимо, чтобы белок как можно меньшее время находился при таких концентрациях. В других случаях для успешной ренатурации необходимо, чтобы белок, наоборот, долго находился в интермедиатном состоянии при определенной концентрации денатуранта.
Именно поэтому в каждом отдельном случаерекомендуется проверять различные градиентные профили (Рисунок 8).JРисунок 8. Примеры градиентных профилей концентрации мочевины.Ренатурация на SEC-колоннах в градиентном режиме концентрации денатуранта открывает новые возможности для ренатурации при высоких концентрациях белка с большим выходом [102].
Однако некоторые белки могут об‑ладать низкой растворимостью при определенных концентрациях денатуранта. Например, химотрипсиноген А плохо растворим при концентрациях гуанидин-гидрохлорида выше 3 М и ниже 0,5 М [103]. Поэтому всегда необхо‑димо проводить предварительные эксперименты по ренатурации целевогобелка при простом разбавлении, и только затем применять полученные результаты для разработки SEC-ренатурации.Крайне эффективной стратегией для предотвращения агрегации являетсяснижение риска межмолекулярных взаимодействий при адсорбции молекулденатурированного белка на твердом носителе.
При этом происходит эффективное разделение молекул друг от друга во время ренатурации.Известно большое количество работ, посвященных рефолдингу денатурированного белка после адсорбции на твердом носителе. В 1962 году Эпштейн сF41коллегами адсорбировали трипсин и рибонуклеазу A на карбоксиметилцеллюлозу для изучения обратимого восстановления их дисульфидных связей[104]. В 1975 году Лайтом [105] была проведена ренатурация химотрипсино‑‑гена А и трипсина с выходом 50-70% после ковалентного присоединения кагарозной гелевой среде.Успех адсорбционной ренатурации напрямую зависит от взаимодействийбелка с матрицей, поскольку они могут препятствовать агрегации и/или мисфолдингу.
Наиболее предпочтительными являются аффинные взаимодействия, поскольку они обеспечивают связывание белка с матрицей через специфические домены, в то время как сам белок остается свободным и можетренатурировать. Например, для специфической иммобилизации на полианионном носителе к молекуле α-глюкозидазы с N- или C-конца пришивалисьгексааргининные катионные пептиды [106]. Гибридные партнеры, такие как‑полигистидиновый таг [107] или целлюлозо-связывающий домен [108] обес‑‑печивают высокую степень связывания даже в присутствии денатурирующихагентов.
В большинстве случаев для сорбции белков в присутствии высокихконцентраций мочевины можно использовать слабые ионообменные сорбенты при подходящем значении рН.Условия адсорбционной ренатурации нуждаются в тщательной оптимизациииз-за неспецифических взаимодействий между белком и матрицей. Низкиеконцентрации солей способствуют ионным взаимодействиям белка с матрицей, которые снижают выход, а высокие концентрации солей – гидрофобнымвзяимодействиям, которые мешают ренатурации.Вслед за разработкой новых адсорбционных сред для белков, в последние десятилетия разрабатывались разнообразные хроматографические методикидля увеличения выхода ренатурации.Для ренатурации в трехбуферной системе Крейгтоном [109] была использо‑вана нековалентная (обратимая) адсорбция денатурированного белка наионообменной среде.
Данная методика проиллюстрирована ниже (Рисунок 9).На колонну, уравновешенную 8 М мочевиной, наносили образец, растворенный в 8 М мочевине. После адсорбции образца концентрацию мочевины вF42колонне постепенно снижали при промывке ренатурационным буфером, чтоприводило к постепенной ренатурации адсорбированных молекул белка. После вытеснения всей мочевины с колонны молекулы ренатурированного, всееще адсорбированного белка смывались при добавлении соли или других добавок в ренатурирующий буфер.JРисунок 9.
Поточная схема трехбуферной системы для ренатурации на ионообменнике (1. Уравновешенная 8М мочевиной колонна с нанесенным образцом; 2. Понижение концентрации мочевины; 3.Начало ренатурации белка на колонне; 4. Десорбция ренатурированного белка с колонны).Методика ренатурации в трехбуферной системе применима не только дляионообменной хроматографии, но и гидрофобной хроматографии [110, 111],‑‑аффинной хроматографии и хроматографии с иммобилизированными ионамиметаллов [112].‑Следует отметить, что методика с градиентом концентрации денатуранта невсегда оказывается успешной. Например, при ренатурации α-лактальбумина сколонны элюировалось не больше 10% нанесенного белка, а при выход ренатурированного куриного лизоцима, полученного при использовании даннойметодики, составил всего 10%.
Существует мнение, что в данных случаях интермедиаты рефолдинга или белковые агрегаты сильно связываются со средой и крайне трудно элюируются с колонны. Для предотвращения накапливания на колонне сильно удерживаемых белков во время ренатурации былаF43разработана методика ренатурации в двухбуферной системе (Рисунок 10)[113]. Образец наносится на колонну и адсорбируется в присутствии 8 М мо‑чевины.
Отрицательный градиент концентрации мочевины реализуется параллельно с увеличивающимся градиентом ионной силы; белок при этом одновременно элюируется и принимает нативную конформацию. На выходе изколонны концентрация мочевины составляет 1 М, а концентрация соли достаточна для элюции белка с колонны.JРисунок 10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
