Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Производные клеточного субстрата: остаточные нецелевые белки продуцента, балластные молекулы ДНК или ее фрагменты, компоненты клеточныхстенок.(2). Производные клеточных культур: индукторы, антибиотики, плазма, компоненты питательных сред.(3). Производные «downstream» процесса: ферменты, химические и биохимические реагенты, неорганические соли, растворители, носители, смытые схроматографических колонн лиганды.В свою очередь, родственные примеси также могут быть трех типов:(1). Продукты ферментативной или химической деградации.(2). Модифицированные формы целевой молекулы: дезамидированные, изомеризованные, окисленные формы, формы с некорректно замкнутыми дисульфидными связями, формы с некорректными конъюгированными остатками (гликозилирование, фосфорилирование).(3).
Агрегаты целевого белка.Таким образом, при разработке процессов выделения и очистки белка необходимо придерживаться двух граничных условий:(1) способы избавления от примесей той или иной природы должны быть оптимальны с учетом должного качества продукта;(2) способы избавления от примесей должны проводиться так, чтобы исключить (или, по крайней мере, минимизировать) деградацию продукта.Основная часть процессуальных примесей берет свое начало на этапе«upstream» процесса. Очевидно, что спектр таких примесей определяется впервую очередь выбором того или иного продуцента. В такой выбор возможен при учете свойств производимого объекта – генно-инженерного белка.Таких свойств два:1. уникальный аминокислотная последовательность терапевтического белка,2. наличие (и их значимость для конечной лекарственной формы) посттрансляционных модификаций, главным из которых является гликозилирование.Первое свойство включает такие параметры, как молекулярная массабелка, удельная гидрофобность, значение изоэлектрической точки (рассчиты-F20ваемое по количеству основных и кислотных а.о.), присутствие цистеиновыха.о.
либо в свободной форме, либо замкнутых в дисульфидные связи, а такженаличие ароматических а.о.Второе свойство – посттрансляционные модификации – обосновывает необходимость выбора того или иного продуцента на этапе «upstream» процесса.Очевидный пример – необходимая степень и вид гликозилирования можетбыть причиной выбора эукариотического штамма, в то время как отсутствиегликозилирования у изучаемого белка позволяет говорить о выборе прокариотического продуцента.Совокупность преимуществ и недостатков того или иного продуцента заставляет выбирать ту или иную систему биосинтеза целевого белка.
Как правило,компромиссным решением является выбор дрожжевых клеток; чаще всего –метилотрофов. Остальные случаи определяются свойствами объекта исследований. Наиболее типичные примеры следующие. Инсулин является достаточно маленьким белком (молекулярная масса 5807 Да) и лишенным профилягликозилирования. В таком случае приоритетом при постановке задачи выбора продуцента является производительность биосинтеза, и, в конечном счете,– рентабельности продукта.
Поэтому наиболее предпочтительными продуцентами являются E.coli и S.cerevisiae [13,14]. С другой стороны, сложные и‑‑большие белковые молекулы, такие как субъединичные и гликозилированныеантитела или фолликулостимулирующий гормон, очевидно, лучше всего производить в клетках животных, наиболее известными из которых являютсяСНО[15,16].‑‑Таким образом, требование к наличию корректного гликозилирования в белкезаставляет выбирать сложные в технологическом плане продуценты – животные клетки, которые обладают целым рядом недостатков.
В первую очередьэто связано с проблемой вирусной контаминации, которую необходимо какминимизировать на каждом этапе производства, так и вводить дополнительные стадии вирусной инактивации в производственный процесс.В то же время, более простые, чем антитела, белковые молекулы, могут бытьпроизведены в бактериальных или дрожжевых культурах, лишенных этих не-F21достатков. Однако и у них есть определенные слабые стороны. Например, отсутствие компартментализации продуктов трансляции, белок-белковых (шаперонных) взаимодействий и посттрансляционных модификаций приводит ктому, что целевой белок биосинтезируется в клетках в ненативном состоянии– чаще всего в виде агрегированных структур, называемых телами включения.
Это заставляет усложнять стратегию «downstream» процесса, вводя втехнологическую цепочку дополнительные стадии денатурирующего растворения тел включения и последующей ренатурации целевой молекулы.Кроме того, в бактериальных и дрожжевых продуцентах целевой белок синтезируется, как правило, в виде гибридного предшественника – молекулы,помимо целевой последовательности аминокислот, еще имеющий лидирующие, сигнальные или скрепляющие последовательности, что также заставляет вводить дополнительные стадии гидролиза этих предшественников с образованием целевых продуктов.Таким образом, базисы биофармацевтики можно представить следующим образом (Рисунок 2).F22FРисунок 2.
Базисы биофармацевтической промышленности.Технология, построенная на этих четырех основах, конечным итогом имеетвысококачественный белок, удовлетворяющий всем требованиям спецификации. Такой белок является high-end продуктом биофармацевтики, надстройкой над описанным базисом.На фармацевтическом рынке присутствуют как оригинальные биофармацевтические препараты, так и биоаналоги (дженерики), воспроизведенные копииоригинальных препаратов. Вопрос «оригинальности» и «воспроизведенности» препарата является достаточно сложным.
Многие такие препаратыпредставляют собой точные биосинтетические копии обычных белков человека и тем самым не могут полностью рассматриваться как оригинальныепрепараты. Как правило, патентная защита биосинтетических препаратовраспространяется на способ производства, но при универсальности методик,заложенных в фундаментальные основы молекулярной и клеточной биоло-F23гии, заранее предусмотренные изменения в схеме получения биодженерикаобеспечивают патентную чистоту препарата. В то же время, демонстрациябиоэквивалентности биодженерика является достаточно сложной задачей. Вэтой связи практическому врачу важно понимать возможные отличия биодженериков от оригинальных препаратов, связанные со способом их получения и реализацией системы контроля качества как АФС, так и ГЛС.2.
Особенности биосинтеза рекомбинантных эукариотическихбелков в бактериальных клетках2.1. Образование тел включенияГлавный успех генной инженерии заключается в разработке бактериальныхэкспрессионных систем, в частности на основе штамм-продуцента E.coli,способных производить большие количества белка [17,18]. Например, техно‑‑логия рекомбинантных ДНК к настоящему времени обеспечивает эффективное производство таких терапевтических белков, как инсулин [19], гормон‑рост [20] и интерферон (Инт) [21].‑‑Для поддержания белков в растворимом состоянии в клетках эукариот реализуются три основные механизма: компартментализация продуктов трансляции, белок-белковые взаимодействия и посстрансляционные модификации.Образующиеся в эндоплазматическом ретикулуме полипептидные цепи нераспределяются хаотически в цитоплазме эукариотических клеток, но последовательно переходят через ряд компартментов, где претерпевают посстрансляционные модификации.
При этом внутренние условия отдельных компартментов могут существенно различаться. Так, молекулы инсулина накапливаются in vivo в секреторных гранулах, рН в которых составляет 4,5-5,5, в товремя как рН цитоплазмы бактериальных клеток приближается к 7,8.
В этихусловиях инсулин лишь слабо растворим. Многие гидрофобные эукариотические белки не существуют в растворимой форме в отсутствие фосфолипидовмембран [22].‑F24Посттрансляционные модификации белков, в частности фосфорилирование,гидроксилирование, гликозилирование и частичный протеолиз, происходящие в определенных компартментах эукариотических клеток, также оказывают большое влияние на растворимость белков, их стабильность и биологические функции. Поскольку в бактериальных клетках соответствующие системы отсутствуют, в них не могут быть получены биологически полноценные рекомбинантные эукариотические полипептиды, что накладывает ограничения на использование бактерий в биотехнологии [23].‑Наконец, третьим ключевым фактором, оказывающим влияние на растворимость белков, является их нативная конформация в растворе.
Правильноесворачивание (фолдинг) полипептидных цепей некоторых белков в клеткахэукариот обеспечивается специфическими белками, называемыми шаперонами, которые необходимы для эффективного формирования третичной структуры полипептидных цепей других белков, но не входят в состав конечнойбелковой структуры [24].‑Поскольку все вышеперечисленные условия, необходимые для поддержанияэукариотических рекомбинантных белков в растворимой форме, не могутбыть реализованы в бактериальных клетках, в них происходит агрегация рекомбинантных белков с образованием тел включения.
Образование ТВ можноохарактеризовать как динамическое равновесие между добавлением в агрегаты и удалением из них частично свернутых белков (Рисунок 3), причем, какправило, движущая сила направлена в сторону нерастворимого состояния[25].‑F25FРисунок 3. Схема процессов с образованием тел включения.В настоящее время не существует универсального метода, который позволялбы получать рекомбинантные эукариотические белки в бактериальных клетках в нативной форме.
В некоторых случаях понижение температуры выращивания рекомбинантных бактерий до 30°С приводит к образованию полностью растворимых рекомбинантных белков. В других случаях добиться синтеза растворимых полипептидов и вовсе невозможно.Однако образование нерастворимых ТВ в бактериальных клетках имеет некоторые плюсы при получении рекомбинантных белков (особенно в промышленном масштабе) [26]:‑(1). Выходы биосинтеза, как правило, очень высокие и достигают 30% общего клеточного белка или около 8,5 г целевого белка с литра культуральнойсреды [23] из-за быстрой сверхпродуктивности при высокой клеточной плотности;(2). Белки в ТВ значительной степени защищены от протеолитической деградации под действием ферментов клетки хозяина;(3).
Во время разрушения клеток и первоначальной очистки можно не опасаться денатурации целевого белка, т.к. агрегированные белки в ТВ не обладают биологической активностью;(4). Белки ТВ легко отделить от растворимых белков клеток хозяина при помощи центрифугирования, фильтрации или гель-фильтрации [27]. Это приво‑F26дит к сокращению числа последующих стадий очистки и увеличению выходаочищенного продукта. При оптимальных условиях процесса полученная паста ТВ может содержать более 90% целевого белка;(5). Если биосинтезируемый целевой белок токсичен или летален для клетокхозяина, то его агрегация в виде тел включения обеспечивает жизнеспособность клеток и увеличивает выход белка;(6). Из-за отличия в преломлении света, образование тел включения можнонаблюдать непосредственно в растущих клетках при помощи фазово-контрастной микроскопии (Рисунок 4), а не проводить электрофоретическийанализ после разрушения клеток.(7).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
