Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Во времяопытов по ренатурации человеческого плазминогенного активатора А обнаружено, что добавление L-аргинин/HCl приводило к значительному увеличению выхода. В последствии было обнаружено положительное влияние L-аргинин/HCl при ренатурации других белков, таких как Fab-фрагмент антител[149], одноцепочечные иммунотоксины [150] и казеин-киназа II [151]. В слу‑‑‑чае с цитохромом С был описан слабый дестабилизирующий эффект L-аргинина [152]. Однако для других модельных белков подобный эффект не на‑блюдался [153].
Несмотря на имеющуюся информацию о влиянии L-аргини‑на на стабильность белка его функция как крайне эффективной низкомолекулярной добавки до сих пор остается загадкой. То же самое касается и другихнизкомолекулярных добавок, которые оказывают положительное влияние наренатурацию [154].‑Недавно было проведено крупное исследование влияния L-аргинина на ренатурацию рибонуклеазы А крупного рогатого скота и куриного лизоцима. Обнаружено, что L-аргинин не стабилизирует данные белки, а снижает агрегацию и способствует обратимости термической денатурации.Стехиометрические количества полиэтиленгликоля облегчают правильнуюпространственную укладку карбоангидразы В при ренатурации. В данномслучае ПЭГ ингибирует агрегацию из-за образования сложных комплексов сглобулами интермедиатов, которые в противном случае склонны к агрегации.Неионные, ионные и цвиттер-ионные детергенты также оказывают благоприятный эффект на процесс ренатурации некоторых белков.
В качестве примераможно привести успешную ренатурацию роданазы в присутствии лаурил-F50мальтозида в концентрации выше его критической точки мицеллообразования [155], ренатурацию фактора роста TGF-β2 из ТВ E.coli в присутствии‑Chaps [156]. Эффективная ренатурация при относительно высокой концен‑трации рекомбинантного белка может быть достигнута при использованиисмесей детергентов (лаурил-мальтозид, Triton X-100) и фосфолипидов [157].‑Эти смешанные мицеллы содержат как полярные, так и неполярные последовательности, которые могут взаимодействовать с различными участками интермедиатов рефолдинга, что препятствует агрегации и мисфолдингу. Получены положительные результаты при ренатурации в присутствии детергентовс последующим добавлением циклодекстрина: данная система функционирует по принципу молекулярной шаперонной системы [158].
В этом случае де‑натурированный белок и интермедиаты рефолдинга растворяются при помощи детергентов. Добавление циклодекстрина необходимо для удаления детергентов с поверхности полипептида. Также было высказано предположение, что циклодекстрин взаимодействует с объемными гидрофобными аминокислотами на концах полипетидных цепей [159]. Именно поэтому цикло‑декстрин также увеличивает растворимость интермедиатов рефолдинга.Недавно было описано влияние ряда N’-алкил- и N’-(ω-гидроксиалкил)-Nметилимидазолинхлоридов на ренатурацию двух модельных белков, лизоцима куриного белка и одноцепочечного фрагмента антител ScFvOx [160]. Ра‑нее ионные жидкости, а именно органические соли с точками плавленияниже 100°С, уже использовались в качестве добавок при ренатурации. Саммерс [161] проводил ренатурацию лизоцима куриного белка при высоких‑концентрациях (0.5 М) в присутствии тетраэтил- и тетрабутил-нитрата аммония, которые эффективно подавляли агрегацию и приводили к значительномуувеличению выхода нативного лизоцима.
Благоприятное влияние ионныхжидкостей на ренатурацию обуславливается их различным взаимодействиемс целевым белком и интермедиатами рефолдинга.Трудно определить точный механизм воздействия добавок на ренатурациюкаждого отдельно взятого белка. Добавки могут влиять как на растворимость,так и на стабильность денатурированного белка, интермедиатов рефолдинга иF51даже ренатурированного нативного белка. Более того, эти добавки могут воздействовать на скорость ренатурации, мисфолдинга и преципитации (агрегации).Обнаружено благотворное влияние полиионных добавок на ренатурацию некоторых белков.
Для ренатурации человеческого фактора роста фибробластов, который в нативном состоянии характеризуется высокой поверхностнойплотностью заряженных остатков, было предложено использовать полианионы [162]. В этом случае нативное состояние молекулы также может быть ста‑билизировано такими полианионами, как гепарин. Стоит отметить, что в этомслучае речь идет еще и об аффинном взаимодействии белка, имеющего гепарин-связывающий участок с очень высокой константой связывания, и указанного полианиона. Кроме того, в литературе упоминается успешная ренатурация некоторых лабильных белков (рибонуклеаза S, фрагмент рибонуклеазыА) в присутствии моноклональных антител [163].‑Существует также ряд химических и биологических агентов для ренатурациибелков, которые имитируют процессы, протекающие in vivo.
К ним в первуюочередь следует отнести природные и искуственные шапероны.Шапероны играют ключевую роль в облегчении in vivo фолдинга и защитеклеточных белков от различных неблагоприятных воздействий, подавляя агрегацию белка. Например, главный шаперонин E.coli GroEL увеличивает выход фолдинга in vivo всех синтезируемых белков на 10% при нормальныхусловиях роста и на 30% при стрессовых условиях роста [164]. GroEL спо‑собствует фолдингу белка за счет быстрого улавливания интермедиатов,склонных к агрегации.
Природные шапероны успешно применяются для ренатурации различных белков in vitro [165]. Однако их примнение крайне‑ограничено из-за их высокой стоимости, относительно высоких концентраций, необходимых для ренатурации (по крайней мере, эквимолярные концентрации целевого белка), и необходимости удаления из раствора после ренатурации [166]. Поэтому процесс ренатурации, основанный на использовании‑природных шаперонов не подходит для промышленного производства белков.F523. Особенности биосинтеза рекомбинантных белков в клеткахмлекопитающихПожалуй, самыми распространенными продуцентами животного происхождения являются яйцеклетки китайского хомяка (СНО), клетки миеломы и гибридомы [167].
Именно они вот уже более десятка лет являются объектами‑пристального внимания генных инженеров и биофармацевтов. И именно ониоптимизируются в первую очередь. Так оптимизации конструкции векторовэкспрессии и специфичных маркеров, а также трансфекции в промышленныхпитательных средах привели к тому, что современные продуценты в состоянии производить 20-60 пкг одной клеткой за день [168, 169].‑‑Другие важные представители продуцентов – НЕК293, ВНК и Cos клетки –известны существенно меньше, и причем, главным образом в производствевирусных частиц и вакцин [170, 171, 172].‑‑‑Превалирующее большинство клеточных линий, используемых в современной биофармацевтике, имеют происхождение от млекопитающих. Однакосправедливости ради стоит отметить, что недавно были созданы линии на основе эмбриональных стволовых клеток птиц (утиные), которые с успехом вытесняют морально устаревшие продуценты предыдущих поколений, используемые в вакцинных производствах.
Такие новые неонкогенные клеточныелинии растут на суспензионных бессывороточных средах и имеют массу преимуществ: отсутствие эндогенных ретровирусов и риска перекрестной контаминации [173].‑Тем не менее, в настоящий момент стоит говорить о преимущественном биофармацевтическом производстве генно-инженерных белков именно в клеткахмлекопитающих, к которым относятся такие яркие представители, как СНОК1 и производные СНО, а именно: DHFR-, DG44 и DUK-B11 клетки. Они популярны, так как позволяют проводить амплификацию целевых внедренныхгенов посредством селекции амплифицирующими маркерами, такими как дигидрофолатредуктаза (DHFR) и глутаминсинтетаза (GS).
Последний работаеткак доминантный селектабильный маркер, который может использоваться какв клетках, экспрессирующих эндогенный GS, так и в клетках, не экспресси-F53рующих его. Огромное число биофармацевтических белков в настоящее время производится в СНО: ферменты, рекомбинантные моноклональные антитела, факторы свертывания крови, факторы роста и их рецепторы, химокиныи прочие поверхностные факторы, адгезионные молекулы и другие [174, 175,‑‑176, 177].‑‑Миеломные линии клеток - например, ns0, Sp2 / 0, а P3X63.Ag8.653 - такжешироко используются для высокопроизводительного получения моноклональных антител.
Ns0 клетки мышиной миеломы часто выступают в качествепроизводственной клеточной линии, так как содержат очень низкие уровниэндогенных GS по сравнению с СНО клетками. Предполагается, что высокаяпроизводительность GS-ns0 линии связана с тем, что ее клетки получены изиммуноглобулин-продуцирующих опухолевых клеток, которые имеют врожденные механизмы для выработки антител. Еще одной важной особенностьюэтих миеломных клеток является их тенденция к росту в суспензии при корректной адаптации к росту в бессывороточной среде.
Несмотря на то, что нарынке уже существует ряд продуктов, получаемых на миелоидных культурах,стоит отметить их нестабильность, а также относительно низкие темпы роста[178].‑В настоящее время проходит апробацию в различных биофармацевтическихкомпаниях новая и довольно интересная культура, основанная линии человеческих клеток, PER.C6, созданная голландской фирмой Crucell Holland BV[179]. Эта новая экспрессионная платформа, по заверению производителя,‑несет в себе ряд преимуществ.
Во-первых, не требуется амплификации внедренных генов для стандартизации клонов, что в случае высокопроизводительного биосинтеза может занимать несколько месяцев. Во-вторых, не требуется селекционного маркера, как в случае с DHFR-клетками. Даже низкойстепени копийности целевого гена достаточно для этой платформы для того,чтобы оставаться стабильной и эффективно биосинтезирующей заданныепродукты. Заявлено, что в биореакторе в режиме прерывного культивирования с подпиткой можно добиться производительности более двух грамм белка с литра среды.
В перфузионном режиме культивирования – до 0,9 г с литраF54за день [180]. Кроме того, тот факт, что PER.C6 имеет человеческое проис‑хождение, заставляет с уверенностью заявлять, что не может быть потенциально иммуногенных некорректных посттрансляционных модификаций всинтезируемых белках. Принимая во внимание расчет жизнеспособностиклеток (порядка 100 × 106 клеток в мл среды) и производительность (в перфузионном режиме) до 0,9 г/л в день, можно говорить, что в будущем такиеклетки могут с успехом заменить все остальные эукариотические виды продуцентов.Итак, клеточные линии, используемые для биосинтеза биофармацевтическихбелков, на протяжении многих лет оптимизировались с учетом следующихпараметров:(1).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
