Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для этого требуется аналитический инструментарий, включающий: пептидное картирование, изоэлектрическое фокусирование, олигосахаридноекартирование, масс-спектрометрия MALDI-TOF, капиллярный электрофорези многое другое.Необходимо несколько подробнее остановиться на гликозилировании, как однои из наиболее определяющих качество эукариотического биосинтеза типепосттрансляционных модификаций.Углеводы, присутствующие на поверхности эукариотических клеткок, выполняют множество функций.
В частности, влияют на фолдинг, модификационные изменения и транспорт секреторных белков, предотвращают или минимизируют агрегацию, сопутствующую обычно процессам фолдинга (настадии образования интермедиатов) путем увеличения растворимости биомолекулы, отвечают за взаимодействия с шаперонами [197, 198]. Кроме того,‑‑гликозилирование в случае белков (в большей степени это относится к мембранным белкам, нежели к секреторным) во многом определяет биологическую активность и биологические свойства. Ведь известно, что с изменения-F59ми в структуре олигосахаридов, находящихся на поверхности клеток, связывают такие патологии, как ревматоидный артрит и рак [199].‑Гликозилирование как видо-, так и тканеспецифичное бывает двух типов: Nи O-сопряженное.
N-связанные гликаны сопряжены с остатками аспарагина впоследовательностях типа Asn-X-Ser/Thr [200]. В процессе этого сопряжения‑в клетке при трансфере из эндоплазмотического ретикулума в аппарат Гольджи олигосахариды претерпевают изменения, индуцированные мембраносвязанными гликозидазами и гликозилтрансферазами (Рисунок 11). Каждая изэтих ферментативных реакций совсем необязательно проходит до конца, чтоприводит к образования различных гликоформ белка. Энзиматическая активность процессирующих ферментов отражает физиологическое окружениеклетки, в которой гликопротеин процессирует. Это может определять иммуногенность, фармакологическую активность, фармакокинетический профиль,растворимость и стабильность глюкизилированного белка [201].‑FРисунок 11.
Процессинг N-сопряженных олигосахаридов в эндоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи (Gluc I – альфа-глюкозидаза I; gluc II – альфа-глюкозидаза II; Man II – альфа-1,2-маннозидаза; GnT I – N-ацетилглюкозаминилтрансфераза I; GnT II – N-ацетилглюкозаминилтрансфераза II;GnT III – N-ацетилглюкозаминилтрансфераза III).F60Процессинг олигосахаридов начинается в эндоплазматическом ретикулуме засчет альфа-гликозидаз I и II и набора процессирующих маннозидаз. Как известно, эндоплазматический ретикулум является окружением, включающимуникальные пути фолдинга белков, центральным из которых является кальнексиновый путь, запускающий фолдинг и тормозящий продвижение некорректно фолдированных (мисфолдированных) молекул к комплексу Гольджи[202, 203].‑‑Каждый сайт гликозилирования может иметь различные степени занятости:сайт может быть полностью занятым, неполностью и вообще незанятым.
Чемболее занят сайт, тем выше разнородность в структуре гликана. Интересно,что степень занятости сайта куда воспроизводимее, чем разнородность в гликозилировании. В целом, разнородность в гликозилировании определяетсятем ферментативным аппаратом, который доступен в тех или иных типахклеток.На занятость того или иного сайта гликозилирования могут влиять как последовательность аминокислот гликозилируемого белка (первичная структура),так и третичная структура. Например, наличие остатка пролина на концахсайта гликозилирования может сильно ингибировать последнее. То же относится к остатка пролина и аспарагиновой кислоты по центру сайта [204].
В то‑же время, если в центре сайта оказывается остаток с гидрокси- или сульфигидрильной группой (серин, треонин и цистеин), то это гарантирует чрезмерно высокую степень гликозилированности белка. Оптимальными в центральном положении считаются остатки аспарагина и глутамина. Отрицательнозаряженные остатки ингибируют, а положительные, наоборот, - ускоряютгликозилирование [205, 206].‑‑Одинаковые типы клеток могут иметь вариабельность в гликозилировании,что, возможно, связано с различным количеством гликозилтрансфераз вовремя жизненного цикла. Когда клетки в стазисном состоянии (что бывает,как правило, только in vivo), ферментативное окружении как в ретикулуме,так и в аппарате Гольджи находится в равновесном состоянии, что имеет результатом воспроизводимость гликозилирования.
Однако в течение культиви-F61рования культуры уровни и ферментов, и субстратов разнятся, что нарушаетвоспроизводимость гликозилирования [207, 208].‑‑Интересно, что СНО-К1 и COS-7 клетки при культивировании в реакторесинтезируют белки с недостатком олигоманнозы в гликане, что говорит о том,что альфа-маннозидаз эти клетки практически не синтезируют. В основномони секретируют альфа-фукозидазу и сиалидазу. Но при этом альфа-маннозидаза обнаруживается в плазме и используется как маркер альфа-маннозидозиса.
Возможно, это связано с тем, что в культуре клетки живут существеннодольше, перерастают, и их питательная среда сильнее закисляется, а болеенизкий рН ближе к оптимальному рН активности альфа-маннозидаз [209,‑210, 211].‑‑Наиболее эффективное производство фармацевтически активных гликопротеинов осуществляется в настоящее время такими системами, как СНО,C127-BPV (мышиные фибробласты) и PER.C6. Самые широко известные иприменяемые клеточные культуры, СНО-К1 и основанные на них, так же каки человеческие клетки, содержат большое количество ферментативных систем, которые могут продуцировать обширный репертуар гликановых форм.При этом эти культуры обеспечивают наиболее высокую степень воспроизводимости профиля гликозилирования (за исключением минорных корреляцийв профили сиалирования и фукозилирования). Например, эритропоэтин и интерферон-бета, производимые в линиях СНО-клеток, всегда лишены α2,6-сопряженных сиаловых кислот, хотя имеют α2,3-сопряжение [212, 213].
При‑‑рассмотрении общей закономерности синтеза Asn-связанных олигосахаридовклетками СНО, наблюдается спектр структур, включающий ди-, три-, тетраразветвленные олигоуглеводные фрагменты и полилактозаминные комплексыс сиаловой кислоты в положениях α2,3. То есть в клетках СНО синтезируются α2,3-сиалилтрансферазы. Так на примере эритропоэтина было продемонстрировано, что его гликозилирование при продукции культурой СНО такоеже, как у эритропоэтина, выделяемого из мочи человека, следовательно, этотрекомбинантный белок вполне может использоваться в клинической практике[214]. Другой пример описывает синтез рекомбинантного интерферона клет‑F62ками С127: такой белок имеет Galα1-3Gal сопряжение гликана, которое вполне типично для большинства млекопитающих, кроме человека. Так как человеческий организм имеет антитело, расползнающее Galα1-3Gal гликаны, такой генно-инженерный белок не может применяться в биофармацевтике[215].‑Итак, СНО-клетки и их производные обладают значительной производительностью по генно-инженерным белкам, могут быть адаптированы к росту всуспензии и жизнеспособны на бессывороточных средах, обеспечивают наиболее эффективный и воспроизводимый, а также максимально близкий к человеческому профиль гликозилирования белков.
Это делает их столь популярными в современной биофармацевтике. Достаточно сказать, что около70 % биофармацевтических белков сегодня производится именно в СНОклетках, что обеспечивает суммарный мировой рыночный потенциал более30 миллиардов долларов в год [216]. Среди уже продаваемых генно-инженер‑ных белков, полученных биосинтезом в СНО-клетках следующие известныебрэнды – в таблице представлены лишь некоторые из них (Таблица 6).Таблица 6. Примеры генно-инженерных белков, производимых в СНО клетках, выпущенных на биофармацевтической рынок.ПродуктТипТерапияПроизводительГодразрешения FDABiopolnЭпоэтин-тетаАнемияCT Arznelmittel2009EporalloЭпоэтин-тетаАнемияRathio Pharm2009FertavidФоллитропин-бетаБесплодиеSchering Plough2009OpgenrarhBMP-7ЗаднепоясничныйHowmedica2009Roche2009Regeneron2008спонделодезRoActemraАнти-HIL6 МАТ*РевматоидныйартритArcalystРилонацептКриопиринассоциированныйсиндромF63ПродуктТипТерапияПроизводительГодразрешения FDAVectibixАнти-EGFR МАТ*Метастазирующий Amgen2006колоректальныйракMyozymeАльфа-глюкозидаза Болезнь ПомпеGenzyme2006AldurazymeЛаронидазаМукополисахаридо Genzyme2006зIOrenciaNaglazymeIg-CTLA4 ГБ**РевматоидныйBristol-MyersартритSquibbN-Мукополисахаридо BioMarinацетилгалактозамиз VI20052005Pharmaceuticalsн-4-сульфатазаLuverisЛютеинизирующий БесплодиеSerono2004гормонAvastinАнти-VEGF МАТ*Метастазирующий Genentech2004колоректальныйрак и рак легкихAdvateФактор-VIIIГемофилия АBaxter2003XolairАнти-IgE МАТ*АстмаGenentech2003RaptivaАнти-CD11a МАТ* ХроническийGenentech2003Болезнь ФабриGenzyme2003РассеянныйSerono2002Abbott2002Amgen2001псориазFabrazymeАльфагалактозидазаRebifИнтерферон-бетамножественныйсклерозHumiraАнти-TNFα МАТ*РевматоидныйартритAranespЭритропоэтинАнемияF64ПродуктТипТерапияПроизводительГодразрешения FDACampathАнти-CD52 МАТ*ХроническаяGenzyme, Bayer2001Wyeth2000лимфоиднаялейкемияReFactoФактор-VIIIГемофилия АTenecteplaseАктиваторИнфаркт миокарда Genentech2000Метастазирующий Genentech1998тканевогоплазминогенаHerceptinАнти-HER2 МАТ*рак грудиEnbrelTNFα рецепторРевматоидныйAmgen, Wyeth1998Wyeth19971997артритBenefixФактор IXFollistim /Фолликулостимули БесплодиеSerono / NVGonal-Fрующий гормонOrganonRituxanАнти-CD20 МАТ*AvonexИнтерферон-бетаГемофилия ВнеХоджкинскиеGenentech,1997лимфомыBiogen IdecРассяенныйBiogen Idec1996Genzyme1994Genentech1993Amgen / Ortho1989множественныйсклерозCerezymeБета-Болезнь ГошеглюкоцереброзидазаPulmozymeДеоксирибонуклеаз ЦистофиброзаIEpogen /ЭритропоэтинProcritActivaseАнемияBiotechАктиватортканевогоплазминогенаИнфаркт миокарда Genentech1987F65ПродуктТипТерапияПроизводительГодразрешения FDA* МАТ – моноклональное антитело;** ГБ – гибридный белок.Особенно стоит отметить, что «downstream» процесс, очевидно, в случаебиопроцесса в клетках СНО должен быть существенно облегчен, так какбольшая часть наиболее патогенных вирусов, включающих вирусы HIV,гриппа, полиомиелита, герпеса, кори не реплицируются в СНО [217].‑4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
