Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Например, ис‑пользование полимиксин-Б-сефарозы (GE Healthcare, Швеция) позволяет получать моноклональные антитела, содержащие менее 0,625 EU/мл (исходно20-100 EU/мл) [266].‑Однако АХ на полимиксиновых сорбентах может быть сопряжена с потерейочищаемого белка вследствие ионных взаимодействий между аминнымигруппами лиганда и отрицательно-заряженными областями белка в растворахс низкой ионной силой. Например, при очистке бычьей каталазы десорбируется только 74-76 % белка, а при очистке бычьего сывороточного альбумина только 80 % [267, 268].‑‑FРисунок 15.
Структура лиганда полимиксина Б.F77Еще одним серьезным недостатком полимиксиновых колонок является возможность загрязенения продукта вымываемым с сорбента лигандом, которыйобладает нейро- и нефротоксичностью и способностью при попадании в организм человека стимулировать высвобождение интерлейкина-1 моноцитами[269, 270].‑‑Сорбенты с привитыми лигандами типа гистамина или гистидина обеспечивают сравнимую с полимиксином специфичность связывания.
Гистамин обладает более высокой аффинностью к эндотоксинам, зато гистидин безопаснее для использования в хроматографической очистке биофармацевтическихбелков, т.к. не обладает такой биологической активностью, как гистамин [271,‑272].‑Стоит отметить, что и полимиксиновые, и гистаминовые / гистидиновые сорбенты достаточно дорогостоящие.Однако такой поликатионный лиганд как поли-ε-лизин существенно дешевлеи более устойчив к вымыванию с сорбента в течение элюции. Сорбент, например сефароза, ковалентно иммобилизованный поли-ε-лизином, объединяет в себе как сильные катионные, так и гидрофобные свойства.
Таким образом, можно элюировать растворы образца с существенной ионной силой (т.е.содержащие большое количество соли, например, до 3 М хлорида натрия);целевой белок не будет связываться с сорбентом, тогда как эндотоксины задержатся. Показано, что поли-ε-лизин позволяет снизить содержание ЛПСниже 0,1 EU/мл даже в случае белков, обладающих кислотными свойствами,например, сывороточного альбумина [273,274].‑‑Свойства аффинных сорбентов, применяемых для очистки от эндотоксиновклеточной стенки, одинаковы и основаны главным образом на сродстве к липидной части ЛПС. При использовании таких сорбентов крайне важно помнить, что эффективность избавления растворов белка от ЛПС зависит от времени контакта матрицы сорбента с элюируемым образцом.
Необходимо такорганизовывать скорость потока, чтобы время контакта было не менее 16 ч.F78Иммобилизованные мембранные фильтры и картриджи. Хроматографическиеметоды избавления от эндотоксинов сегодня могут быть заменены на методы,основанные на фильтрации растворов через особые мембраны или картриджи. Эти мембраны или картриджи могут быть иммобилизованы любым изописанных в данном обзоре лигандом; чаще всего используются иммобилизации с помощью ДЭАЭ, полимиксина и поли-ε-лизина. Такие коммерческидоступные системы существенно дешевле сорбентов, они стерильны и апирогенны в отличие от сорбентов, и не нужно тратить время на упаковку колонны и ее депирогенизацию.Однако, как уже отмечалось выше, время контакта депирогенизируемого раствора с лигандами мембраны / картриджа является наиболее критическим параметром процесса, что в конечном итоге ограничивает использование подобных систем.Итак, технология рекомбинантных ДНК позволила получать множество белков, предназначенных для терапевтических целей.
При этом чаще всего длябиосинтеза целевых продуктов используются штамм-продуценты Escherichiacoli, т.к. культивировать прокариотические микроорганизмы дешевле посравнению с эукаритиоческими клетками, бактерии способны быстро синтезировать белки в больших количествах, и, наконец, накоплен значительныйопыт работы именно с E. coli. Однако процесс ферментации продуцента сопряжен с тем, что продукт загрязнен эндотоксинами клеточной стенки. Стольпирогенные и токсичные примеси необходимо удалять из растворов белка допредельно допустимых значений. Но эндотоксины – это очень стабильныесоединения.
Например, для того, чтобы их разрушить, необходимы высокиетемпературы (180-250 0С) и крайние значения рН (0,5-1,0 М NaOH или 1-2 Муксусная кислота). Также их отрицательный заряд и наличие гидрофобныхучастков могут способствовать образованию комплексов с белками. Следовательно, очистка белков от эндотоксинов является очень сложной задачей, вынуждающей иногда вводить дополнительные стадии в «downstream» процессе.F79Обширный ассортимент способов, предложенных для избавления от ЛПС, вочередной раз подтверждает, насколько бывает сложно достичь необходимыхстепеней чистоты в том или ином производственном процессе получениябиофармацевтических белков. Среди таких способов можно выделить хроматографические и нехроматографические.К первым относятся ионообменная, обращено-фазовая, аффинная, гель-проникающая хроматография и хроматография гидрофобных взаимодействий.Нехроматографические способы включают ультрафильтрацию и двухфазнуюэкстракцию.
Оба метода отлично справляются с задачей очистки от эндотоксинов растворов, не содержащих белки. Однако в случае необходимостиочищать целевые белки описанные методы малоэффективны. Особое местозанимают фильтрационные мембраны и картриджи, которые являются своегорода упрощенным вариантов ионообменной и / или аффинной хроматографии.4.2. Очистка от фрагментов нуклеиновых кислотОстаточные нуклеиновые кислоты и их фрагменты, как правило, не представляют большой проблемы при очистке генно-инженерных белков. Это связано с тем, что их свойства уж слишком ярко выражены: большой отрицательный заряд и существенная гидрофобность.
Очевидно, что практическивсе известные хроматографические методы, из которых наиболее предпочтительными кажутся ионообменная хроматография, ОФ ВЭЖХ и хроматография гидрофобных взаимодействий, являются достаточно эффективными.К нехроматографическим методам избавления от фрагментов нуклеиновыхкислот можно отнести кислотную экстракцию и белковое солевое осаждение.Для кислотной экстракции на этапах выделения белка из клеток в раствор гомогената добавляют 1-3 % хлорную кислоту при интенсивном перемешивании [275].
В результате в течение короткого срока (от нескольких минут до‑пары часов) большая часть молекул нуклеиновых кислот преципитирует.F80Осадок удаляют с помощью декантации, сепарации, центрифугирования илитангенциальной фильтрациии.Возможен и другой подход – осаждение целевого белка. Для этого используют различные соли (хлорид натрия, сульфат аммония и т.д.), наиболее удобные в соответствии с рядом Гоффмайстера [276].
Фрагменты нуклеиновых‑кислот не преципитируют и остаются в надосадочной жидкости.4.3. Очистка от вирусовВирусная, а также прионная, контаминация является наиболее опасной длячеловека. Естественно, в первую очередь это относится к культурам клетокмлекопитающих. Для оценки эффективности очистки от вирусов введенаединая система расчета LVR, логов избавления от вирусов (log-viralreduction). LVR рассчитывается по разности десятичных логарифмов количества вирусных частиц в титре до очистки и в титре после очистки. Очевидно,что чем выше значение LVR для той или иной стадии «downstream» процесса,тем она более эффективна [277].‑Наиболее известными и проверенными методами очистки от вирусов являются ионообменная, аффинная хроматографии, хроматография гидрофобныхвзаимодействий, ОФ ВЭЖХ, инактивация пониженными значениями рН(Таблица 7) [278].‑Таблица 7.
Типичные приемы очистки от вирусов.Метод очисткиLVRАффинная хроматография4,23Катионообменная хроматография2,13Анионообменная хроматография4,98Хроматография гидрофобных взаимодействий4,19Инактивация при низком рН> 4,4F81Интересно, что инактивация вирусов в низких значениях рН является однимиз наиболее эффективных способов избавления от этих примесей. Для этого врастворе целевого белка понижают рН до 3,0 и ниже (если это возможно и неспособствует преципитации, деградации белка или потери его активности) на1 ч и более. После чего раствор подвергают ультрафильтрации на мембранах20-80 нм.4.4. Очистка от родственных белковВ широком смысле слова, родственные белки – это, с одной стороны, это могут быть продукты агрегации белков, а с другой – продукты деградации.Агрегаты – примеси более высокого порядка, чем целевой генно-инженерныйбелок.
Поэтому одним из наиболее популярных методов очистки от агргегатов является гель-фильтрация.Особого внимания заслуживает сорбент, который используется при гельфильтрации. Чаще всего для этих целей используют сефадексы, впервые введенные в практику Поратом и Флодином [279].
В настоящее время основным‑производителем сефадексов является корпорация GE Healthcare (ранееAmersham Biosciences, Pharmacia, Швеция). Однако в нашей стране подобныйгидрофильный гель также был разработан и запатентован [280]. Показано,‑что осмотическая стабильность отечественного сорбента для гель-фильтрации даже выше стабильности зарубежных аналогов.Пожалуй, самым изученным примером агрегаций является процесс фибриллообразования инсулина. Инсулин образует фибриллы (волокна) при концентрациях свыше 5 г/л в водных растворах, причем показано, что средняя молекулярная масса агрегатов достигает 200 кДа [281, 282, 283].
Вид агрегации‑‑‑зависит от pH, температуры, ионной силы и природы органического растворителя. Так, при 25°С в 3,5 М растворе уксусной кислоты (рН 2,61) инсулинсуществует преимущественно в виде мономеров, что подтверждено при помощи турбидиметрического метода (длина волны 400 и 350 нм) [284, 285,‑‑286]. Однако при снижении рН раствора до 2,0 или при повышении темпера‑F82туры до 60 °С, инсулин быстро образует волокноподобные структуры, которые со временем превращаются в нерастворимые агрегаты [287].‑Предполагается, что кислые условия ускоряют агрегацию путем образованиязаряженного окружения белковых молекул, в котором увеличиваются силыпритяжения между инсулиновыми молекулами. Также кислая среда способствует диссоциации олигомеров инсулина в мономеры; мономеры затем подвергаются структурным изменениям, приводящим к частично свернутым интермедиатам, которые склонны к образованию фибрилл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
