Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Однако и тот способ, который‑описан в патенте [313], хоть и позволяет получать Инт-Г с гораздо более высоким выходом биопроцесса, тем не менее и сам не лишен недостатков. Делов том, что повысить выход и улучшить процесс денатурации тел включения(и последующей ренатурации целевого белка) авторы смогли за счет изменения конструкции биосинтезированного белка – в нем попросту удалена последовательность из десяти а.о., включающая дисульфидную связь. Конечно,такая замена должна была сказаться положительно на всем «апстрим»-про-F94цессе. Однако сама молекула получаемого авторами патента белка теперь неидентична человеческому Инт-Г. По-существу, это модифицированный аналог Инт-Г, пролонгированная терапия препаратами на основе которого можетприводить к различным аутоиммунным патологиям.5.2.2. Этапы “downstream" процессаСреди наиболее современных описаний методов выделения и очистки рекомбинантного Инт-Г следует отметить отечественный патент [313].
Биомассуклеток E. coli MH-1/pIFN D10, выращенную на среде М9 с добавлением казаминовых кислот, суспендируют в буфере для разрушения (50 мМ трис-HCl, 1мМ CuCl2, 1 мМ ZnCl2, рН 8,3) до гомогенного состояния. Суспензию подвергают обработке ультразвуком до снижения оптической плотности придлине волны 550 нм до 50-60% от исходного значения. Клеточный дебрис после центрифугирования удаляют, а супернатант наносят на колонку с КМ-сефарозой, уравновешенную буфером А (50 мМ Трис-HCl, рН 8,3). Нагрузка наколонку составляет 6-10 мг белка на 1 мл сорбента. Колонку промывают буфером А до снижения оптической плотности в вытекающем растворе придлине волны 280 нм до исходного значения и белки элюируют линейным градиентом буферов следующего состава: 50 мМ Трис-HCl, рН 8,3 (буфер А) - 50мМ цитрат натрия, рН 6,5 с 0,5 M NaCl.
Фракции, содержащие Инт-Г, объединяют и диализуют против 2 л буфера Б (50 мМ цитрат Na, рН 6,5) в течение 12 часов при температуре 6°С. Доочистку Инт-Г проводят рехроматографией на КМ-сефарозе, предварительно уравновешенной буфером Б. ЗначениерН раствора белка перед нанесением доводят до значения рН 6,5, добавляя покаплям 0,1 М раствор соляной кислоты. После нанесения колонку промываютбуфером Б до снижения оптической плотности в вытекающем растворе придлине волны 280 нм до исходного значения.
Элюцию белка осуществляютэкспоненциальным градиентом следующего состава: буфер Б (50 мМ цитратNa, рН 6,5) - буфер А (50 мМ трис-HCl, рН 8,3 с 1 М NaCl). Фракции субстанции Инт-Г объединяют и диализуют против 1л буфера В (10 мМF95КН2РО4, 0,15 М NaCl, рН 7,0) в течение 12 часов при температуре 6°С. После диализа субстанцию дельтаферона стерилизуют ультрафильтрацией, используя мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Электрофоретическаячистота конечного препарата составляет более 98%.Очевидными недостатками этого способа являются многочисленные стадиихроматографий-рехроматографий, а также использование лабораторного диализа, который практически невоспроизводим при масштабировании. По существу, описанная в патенте технология является лишь лабораторной и неможет обеспечить производительностей, необходимых для производства рыночных партий препарата.5.3.
ФоллитропинФолликулостимулирующий гормон (фоллитропин, ФСГ) - гликопротеид смолекулярной массой около 30 кДа. Его молекула состоит из α- и β-цепей(субъединиц): α-цепь аналогична α-цепи лютеинизирующего гормона (ЛГ) ине обладает гормональной активностью. Специфическое гормональноедействие связано с β-цепью, однако для проявления гормональной активности необходимы обе субъединицы.ФСГ секретируется базофильными клетками аденогипофиза в ответ на секрецию гонадотропин-рилизинг факторов гипоталамуса. У женщин ФСГ контролирует циклические изменения яичников во время нормального менструального цикла.
Стероиды яичников моделируют секрецию ФСГ, которая всвою очередь регулирует менструальный цикл. У мужчин ФСГ, ЛГ и тестостерон стимулируют сперматогенез в семенных канальцах яичек.Фоллитропин-α - рекомбинантный ФСГ, полученный методом генной инженерии из клеток СНО, стимулирует образование фолликулов. Одним из примеров экспрессии ФСГ с использованием рекомбинантной технологии является трансфекция эукариотических клеток с ДНК последовательностью, кодирующей α- и β-субъединицы ФСГ.F965.3.1. Вектор экспрессии рекомбинантного фоллитропинаТак как ФСГ состоит из α- и β-субъединиц, то для экспрессии обеих субъединиц необходим либо один вектор, содержащий промотор для каждой из них,либо два вектора для каждой субъединицы в отдельности.Кроме того, каждый вектор экспрессии млекопитающих содержит элементы,которые могут присутствовать на одном или нескольких векторах, включаяэнхансеры и промежуточные последовательности в окружении донорных иакцепторных сайтов сплайсинга для РНК [314].‑Высокоэффективная транскрипция может быть достигнута посредством использования сильных промоторов из SV40, длинных концевых повторов отретровирусов, например, RSV, HTLVI, HIVI и промотора цитомегаловируса(ЦМВ).
Также могут быть использованы клеточные элементы (например, человеческий промотор актина). В качестве клеток-хозяина могут быть использованы клетки млекопитающих, содержащие человеческий Hela 293, H9 иJurkat, мышиный NIH3T3 и C127, клетки Cos 1 Cos 7 и CV 1, перепелиныеQC1-3, клетки мышей L и клетки СНО.Трансфектная ДНК последовательность для субъединиц может быть усиленадля того, чтобы транслировать большее количество закодированного полипептида. Маркер DHFR (дигидрофолатредуктаза) необходим для полученияклеточных линий, которые содержат несколько сотен или даже несколько тысяч копий целевого гена.
Фермент глютамин синтазы (GS) также является необходимым [315]. Используя эти маркеры, клетки млекопитающих растут в‑селективных средах, а затем из них выделяются клетки с высокой резистентностью. Эти клеточные линии содержат усиленный ген, интегрированный вхромосому. Клетки СНО часто используется для производства белков и полипептидов.Экспрессионная плазмида для ФСГ производится клонированием комплементарной ДНК, кодирующей ФСГ в вектор экспрессии pcDNAI / Amp илиpcDNAIII (которая может быть получена от Invitrogen, Inc., США) Как упоминалось ранее, каждая субъединица требует экспрессии для полученияфункционального гетеродимера либо из независимого введения отдельныхF97векторов в клетки-хозяина, либо из одного вектора, экспрессирующего α- и βсубъединицы.Кассета вектора экспрессии содержит кодирующие ДНК последовательностидля α-субъединицы - SEQ ID NO: 5; для β-субъединицы - SEQ ID NO: 11 инаходятся под контролем двух разных промоторов: CMV для β-субъединицыи EF1 для α-субъединицы.
Каждая последовательность α- и β-субъединицыиспользует бычий гормон роста полиА. Кроме того, вектор содержит ген глутамин синтетазы, управляемый промотором SV40 и содержащий хвост полиАSV40, и используется в качестве селективного маркера. Этот вектор был использован для трансфекции CHO-К1 клеток [316].‑Линия клеток выращивается в GibcoBRL CD СНО под селективным давлением L-метионин сульфоксимина. ИФА используется для определения ФСГ.5.3.2. Очистка рекомбинантного ФСГОчистка гетеродимера ФСГ, состоящего из α- и β-субъединиц, может бытьосуществлена из монослоя или суспензионной культуры клеток CHO-К1 рядом методов. Указанным ниже способом очистки можно получить рекомбинантный ФСГ максимально высокой чистоты, который может быть представлен в готовом лекарственном средстве, например, Гонал-Ф (Serono-Merck,Германия, Швейцария).
Этот метод имеет преимущество обеспечивать высокую степень чистоты без использования иммуноаффинной хроматографии[317].‑Антиоксидант присутствует в любом из буферов, используемых для очисткии / или концентрации и / или фильтровании ФСГ. Антиоксидант предотвращает окисление ФСГ во время обработки.
Предпочтительным антиоксидантом является L-метионин, который предпочтительно использовать в концентрации 10-100 мМ. Также в качестве антиоксидантов может быть использован трет-бутил-4-метоксифенол, 2,6-бис(1,1-диметилэтил)-4-метилфенол, биметабисульфит натрия или калия, бисульфит натрия. Примерами свободныхF98аминокислот и дипептидов с антиоксидантным эффектом являются гистидин,таурин, глицин, аланин, карнозин, 1-метилгистидин или их комбинации [318].‑Как правило, исходный материал очищают, а затем, по возможности, концентрируют, например, ультрафильтрацией и диафильтрацией.На стадии очистки применяют аффинную хроматографию с использованиемкрасителя голубого (например, Blue Dye Sepharose, GE Healthcare, Швеция),хроматографию гидрофобных взаимодействий (ХГВ) и ОФ ВЭЖХ.Первым этапом является аффинная хроматография с использованием красителя.
В данном случае она осуществляется с помощью матрицы, имеющей вкачестве иммобилизованных лигандов широко известное красящее соединение, Cibacron Синий F3G-A.Хроматография также может быть выполнена с альтернативными видамиматриц, имеющими аналогичные характеристики. Примерами альтернативных матриц являются: Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh, Япония),Toyopearl SuperButyl 550 (Tosoh), Toyopearl Phenyl 650 (Tosoh), синий CellthruBigBead (Sterogene, США), SwellGel Blue (Pierce, США), CibachromeBlue3GA-агарозы 100 (Sigma, Германия), Affi-Gel Blue (Bio-Rad, США),Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad), Blue sepharose HP (GE Healthcare),Cibacron Синий 3GA (Sigma).Культуру клеток, содержащую ФСГ, наносят непосредственно на матрицу.После нанесения сорбент промывают уравновешивающим буфером, а затемэлюируют фосфатным буфером, предпочтительнее фосфатом натрия; рНэлюента поддерживают 6,0- 8,0.
Буфер для элюирования должен содержатьсоли, предпочтительно NaCl, для увеличения проводимости, а также антиоксидант, например L-метионин. Первый этап очистки осуществляется при2-8˚С.Второй шаг – ХГВ. В предпочтительном варианте ХГВ осуществляют насорбенте бутил Toyopearl 650M (Tosoh) при комнатной температуре.Также могут быть использованы альтернативные типы матриц, имеющиеаналогичные характеристики: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow; Butyl Sepharose 4Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Source 15PHE (GE Healthcare).F99Связывание в ХГВ проводят в буфере с высокой проводимостью (высокойконцентрацией NaCl, (NH4)2SO4 или Na2SO4). Элюируют на этапе ХГВ преимущественно за счет снижения проводимости подвижной фазы (сниженияконцентрации солей) буфером с рН 6-8, причем наиболее предпочтительнозначение для рН около 7,0.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
