Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Показано, что оптимальным является ведение процесса при скорости 0,5 мл/мин (что соответствует линей-Высота, эквивалентная теоретической тарелке, ммной скорости, равной 65 см/ч), когда ВЭТТ была ниже 0,02 мм (Рисунок 21).0,200,180,160,140,120,100,080,060,040,020,000,00,51,01,52,0Объемная скорость потока, мл/минFРисунок 21. Графическая характеристика Ван Димтра.1.1.3. Валидация метода анализа: определение диапазона линейности.Необходимо показать, что площадь пика мономера РП, оцениваемая в результате SEC теста, пропорциональна его концентрации в образцах в пределахтого интервала, который установлен для данного метода.
Определялся диапазон линейности концентрации мономера РП внутри установленного интервала от 1 до 16,0 мг/мл.Таким образом, были приготовлены образцы с концентрациями мономера РП1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16 мг/мл. Каждый образец был проанализирован четыре раза, площади хроматографических пиков (отклики) автоматическиF108определялись программой HP Chem, рассчитанные значения использовалисьдля построения регрессионной линии методом наименьших квадратов.
Приэтом было отмечено, что линейность соблюдается только в диапазоне от 1 до14 мг/мл Коэффициент линейной R был равен до 0,99898 (р менее 0,0001) дляn=32.Уравнение регрессионной линии приняло вид (Ф1):A=(33,644±3,9848)+(619,87±1,6023)×СФ1гдеА - площадь пика (AU);С - концентрация мономера РП, мг/мл.Среднеквадратичное отклонение Sxy=116,97, а относительная систематическая ошибка составила 2,63 %.Таким образом, с уровнем значимости 0,05 было показано, что результатыопределения концентрации мономера РП изменяются линейно внутри установленного диапазона.1.1.4. Валидация метода анализа: правильность и точность.Правильность метода – это близость получаемых результатов к истинномузначению.
Под точностью понимают близость друг другу результатов отдельных тестов, поведенных в одинаковых условиях (сходимость) или выполненных при различных условиях (воспроизводимость), как-то: на различныхприборах, различными аналитиками и т.п. В соответствии с требованиямиGMP к методам внутрипроизводственного контроля систематическое отклонение, или bias (характеристика правильности), и коэффициент вариации(относительная систематическая погрешность), или CV (характеристика точности), не должны превышать 15 % [325, 326].‑‑Правильность и точность метода SEC анализа оценивались для образцов сконцентрациями мономера РП 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 мг/мл. Для определенияправильности и сходимости проводилось по 4 определения каждого образца втечение одного дня, одним аналитиком, на одном и том же приборе, с использованием одной и той же хроматографической колонны.
Обнаружено, чтоF109значения систематического отклонения лежат в диапазоне от -6,50 до 4,63;значения коэффициента вариации изменяются от 4,43 до 10,25 % (Таблица 9).Таблица 9. Измерение концентрации РП в образцах (108 опытов).Номинальнаяконцентрация РП вобразце, мг/млИзмереннаяконцентрация РП вобразце, мг/млОтклонение (bias), %CV, %В ТЕЧЕНИЕ ОДНОГО ДНЯ11,02 ± 0,061,965,8822,07 ± 0,123,385,8044,06 ± 0,181,484,4365,84 ± 0,26-2,744,4588,38 ± 0,644,537,64109,39 ± 0,84-6,508,951211,80 ± 1,21-1,6910,251414,68 ± 1,364,639,26В ТЕЧЕНИЕ НЕСКОЛЬКИХ ДНЕЙ11,03 ± 0,052,914,8522,07 ± 0,113,385,3143,96 ± 0,14-1,013,5466,03 ± 0,30,054,9887,81 ± 0,70-2,388,96109,71 ± 0,68-2,997,001211,71 ± 0,89-2,487,601414,11 ± 0,710,785,03Воспроизводимость и правильность метода в диапазоне нескольких днейоценивались в течение 5 дней на восьми образцах с теми же концентрациями(каждый день готовились новые образцы) путем проведения по 4 определения каждого образца.
Значения систематического отклонения изменялись от 2,99 до 3,38; коэффициент вариации изменялся от 3,54 до 8,96.F110Номинальные концентрации РП в образце ниже 2 мг/мл и выше 8 мг/мл даютпри определении значительные погрешности, поэтому анализ лучше проводить для интервала концентраций (2÷8) мг/мл. Как значения коэффициентоввариации, так и значения относительных стандартных отклонений не превышают установленного рекомендациями GMP предела в 15 %, следовательно,можно считать метод производственного контроля правильным и точным.1.1.5.
Валидация метода анализа: пределы обнаружения и количественнойоценки.Предел обнаружения (LOD, или limit of detection), т.е. такая концентрация РП,которая может быть неколичественно обнаружена в образце, может бытьопределен следующим образом:гдеLOD=3,3σ/BФ2σ - стандартное отклонение от отклика на поглощение;B - точка перегиба калибровочной кривой.Стандартное отклонение от отклика на поглощение определяли путем хроматографирования семи «холостых» проб, не содержащих целевого белка.Было рассчитано, что предел обнаружения составил 30 мкг/мл.Предел количественной оценки (LLOQ, или low limit of quantitation), представляющий собой такую минимальную концентрацию белка, которую можно определить количественно, оценивали следующим образомLLOQ=10σ/BФ3Таким образом, было рассчитано, что предел количественной оценки составил 0,1 мг/мл.
При этом погрешность и коэффициент вариации составили-8,98 и 13,22% соответственно. Поскольку в соответствии с рекомендациями,погрешность и коэффициент вариации при определении LLOQ не должныпревышать 20%, то разработанный метод можно считать валидным в минимальных концентрациях белка не ниже 0,1 мг/мл.F111В качестве верхнего предела детекции (на длине волны 280 нм) была выбранаконцентрация РП, равная 14 мг/мл, выше которой отсутствует линейностьопределения концентрации.1.1.6.
Валидация метода анализа: специфичность.Это одна из самых важных характеристик, поскольку позволяет оценить возможность метода измерять точно, правильно и селективно значение определяемого компонента в смеси с примесными веществами, которые могут ожидаться в системе.Процесс выделения рекомбинантного белка из ТВ и его фолдинг в нативноесостояние сопровождается побочной агрегацией образца с образованием димерных и мультимерных форм РП. При этом содержание мономерной формыРП составляет 50-60%. Вышеупомянутые мультимерные формы (по даннымMALDI-TOF, в основном димерные и тримерные формы, Рисунок 22) могутобразовываться во время хранения раствора РП (степень полимеризации зависит главным образом от температуры, рН и времени хранения).
Кроме того,во время ренатурации восстановленного РП некоторая часть белка можетостаться в восстановленном состоянии. При этом время удерживания восстановленного РП меньше, чем ренатурированного. Это связано, по-видимому, стем, что радиус Стокса денатурированной молекулы выше, чем более компактной ренатурированной.F112FРисунок 22. SEC – хроматограмма ренатурированного РП (верхний рисунок) и масс-спектрометрическое определение состава примесей (нижний рисунок).
На хроматограмме: пик 5 – ренатурированныймономер РП, пик 4 – восстановленный мономер РП, пики 1-3 – димерная и мультимерные формы РП.На масс-спектре: хроматографические пики 1-3 представляют собой вещества с массами 35328 и52979 Да, что соотествует димерной и тримерной формам соответственно.Ренатурированный РП может быть отделен от этих примесей во время анализа с удовлетворительным разделением, близким к рекомендованному Фармакопеей [327]. Для определения специфичности использовали 3 раствора очи‑F113щенного РП с концентрациями 6,00; 7,00 и 12,00 мг/мл.
Три аликвоты этихрастворов были смешаны 1:1 с тремя аликвотами растворов, содержащихмультимерные формы РП в концентрации 2,14; 3,12 и 4,26 мг/мл. Таким образом, получили три раствора с различными концентрациями ренатурированного мономера РП 3,00; 4,50 и 6,00 мг/мл. Полученные данные представленыниже (Таблица 10).Таблица 10. Специфичность метода (n=12).Реальнаяконцентрацияденатурированногобелка, мг/млРассчитанное Рассчитанная концентрацияренатурированного белка, мг/содержаниемлмономернойформы, %Среднее±SD (мг/мл) CV (%)6,0089,106,24±0,345,454,004,5084,104,49±0,276,01-0,223,0079,283,16±0,226,965,33bias,%Как видно из представленных результатов, отклонения в определяемых величинах не превысили 15 %, следовательно, метод можно считать специфичным.1.1.7.
Валидация метода анализа: устойчивость.Под устойчивостью метода подразумевают его способность обеспечивать достоверными результатами при некотором отклонении условий анализа от изначально заданных. Рекомендуется варьировать не менее чем на 5 % от установленных такие параметры процесса, как скорость потока, состав подвижной фазы, температуру и т.д.Для оценки устойчивости метода варьировались такие параметры, как скорость потока от 0,4 до 0,6 мл/мин; температура процесса от 18 до 22°С; состав подвижной фазы (содержание ацетонитрила от 10 до 20%, уксусной кислоты от 10 до 20%, L-аргинина от 6 до 8 мг/мл). В качестве параметров кон-F114троля были выбраны (S) – отношение площади пика мономера к его концентрации; (К) – коэффициент распределения.S = Площадь пика/КонцентрацияФ4К= RФ5где tR – время удерживания РБ, t0 – время удерживания низко-молекулярныхсоединений (солей).После 25 анализов образца определялись средние значения S и K, а такжестандартные отклонения этих значений: 633,85±28,8 и 0,635±0,06 соответственно.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
