Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 16
Текст из файла (страница 16)
По прогнозам ВОЗ, запериод 2005-2030 гг. число случаев смерти от диабета удвоится [301].‑Развитие биотехнологических методов позволило в последние 10 лет создатьи ввести в лечебную практику новые аналоги инсулина человека, обладающие дополнительными терапевтическими преимуществами при сохраненииполноценной гипогликемической активности. Примерами таких внедренийявляются аналоги инсулина сверхбыстрого (лизпро и аспарт) и пролонгированного (гларгин, детемир) действия.Лизпро – быстродействующий аналог инсулина человека, у которого в аминокислотной последовательности B-цепи инвертированы остатки Pro29 иLysB29 (Рисунок 17). Конформационные изменения C-концевой последовательности B-цепи гормона заметно снизили димеризацию молекул белка, характерную для инсулина человека.
Уменьшение склонности белка к образованию агрегатов увеличило скорость абсорбции инсулина лизпро после инъекции, обеспечило более высокий уровень содержания препарата в плазме иснизило продолжительность действия [302].‑F88FРисунок 17. Структурная формула инсулина лизпро.Аспарт – еще один используемый в клинической практике генно-инженерныйаналог инсулина быстрого действия. В молекуле аспарта-инсулина остатокпролина в положении 28 B-цепи заменен остатком аспарагиновой кислоты(Рисунок 18).
Эта замена снизила тенденцию мономерных молекул инсулинак агрегации из-за нарушения взаимодействия между остатками Pro28 иGlyB23 [303].‑FРисунок 18. Структурная формула инсулина аспарт.Гларгин – пролонгированный аналог инсулина человека, в структуре которогоостаток аспарагина А21 заменен на остаток глицина, а В-цепь удлинена надва положительно заряженных остатка аргинина ArgB31, ArgB32, благодарячему pI смещается до 6,7. Изменение изоэлектрической точки в итоге приводит к пролонгации действия препарата.Детемир – еще один генно-инженерный аналог инсулина пролонгированногодействия. Молекулярная структура детемира отличается от структуры человеческого инсулина отсутствием треонина в положении В30 и присоединением к лизину в положении В29 миристиновой кислоты – жирнокислотногоостатка из 14 атомов углерода [304].
Ацилирование молекулы инсулина жир‑F89ной кислотой обеспечивает связывание с альбумином и пролонгирует всасывание из подкожно-жирового слоя, а также обеспечивает растворенное состояние препарата после инъекции.Наибольший прогресс в производстве инсулина, как и других терапевтических белков, был достигнут с применением генно-инженерных методов длясоздания соответствующих трансгенных микроорганизмов-продуцентов[305]. Развитие генно-инженерных методов привело к большому выбору си‑стем экспрессии, к примеру, аналоги инсулина можно получать, применяя такие экспрессионные системы, как Escherichia coli, Pichia pastoris,Saccharomyces cerevisiae, клетки CHO и др.
[306].‑5.1.1. Стадии технологического процессаПроцесс получения инсулина и его аналогов в бактериальных экспрессионных системах можно условно разделить на следующие стадии:ферментация (выращивание штамма-продуцента в ферментере);отделение биомассы и дезинтеграция клеточной суспензии с выделением телвключения;выделение и очистка рекомбинантного белка;ферментативное расщепление рекомбинантного белка;хроматографическая очистка инсулина или его аналогов;получение кристаллического инсулина или его аналогов.При использовании рекомбинантных клеток E. coli для получения аналоговинсулина, которые накапливаются в составе гибридных белков в телах включения [307].‑Наиболее общая стратегия, используемая для ренатурации нерастворимыхбелков, включает три этапа:1) выделение и отмывка тел включения;2) солюбилизация агрегированного белка;3) рефолдинг солюбилизированного белка.F90Конечный выход целевого белка лимитируется повторной укладкой белковоймолекулы (рефолдинг, или ренатурация), что связано с возможностью образования неактивных форм (продукты неправильного фолдинга), а также высокомолекулярных агрегатов при приобретении белком нативной конформации.Для масштабирования на производственном уровне процесса ренатурациибелков необходимыми условиями являются достижение высокой степениправильно свернутого (фолдированного) продукта при высокой концентрации; кроме того, процесс должен быть быстрым, недорогим и высокоэффективным [308].‑5.1.2.
Технология получения рекомбинантного инсулина гларгинаОписана технология получения рекомбинантного инсулина гларгина с использованием метилотрофных дрожжей Pichia pastorus в качестве продуцента [309]. Его получают методами трансформации штамма-реципиента GS115‑P. pastorus плазмидами pPIC9K. Плазмида содержит ген устойчивости к генитицину для последующей селекции трансформантов.Штамм культивируют в среде, состоящей из ортофосфорной кислоты, сульфата калия, гидроксида калия, сульфата магния, сульфата кальция, глицеринаи биотина, в качестве индуктора используют метанол.В ходе отделения предшественника инсулина гларгина от фрагментов клетокразбавленный продукт пропускают через колонну, упакованную сорбентом SPSepharose FF (GE Healthcare, Швеция) и уравновешенную 50 мМ уксуснойкислотой при значении pH в образце 3,8.
Элюируют раствором ацетатом аммония.Целевой гларгин получают из предшественника методом ферментативногорасщепления. Гидролиз проводят в присутствии водорастворимых органических растворителей, таких как ДМСО, ДМФА, этанол, ацетон, ацетонитрил,этилацетат и др. (наилучших результатов добиваются в ДМФА и ДМСО). Содержание органического растворителя составляет 40-60% по объему реакционной смеси.
Концентрацию белка-предшественника поддерживают равнойF9110 г/л (разбавляя или концентрируя ультрафильтрацией) при добавлениитрипсина с концентрацией 50 мг/л. Процесс ведут при температуре 6±2°С примедленном перемешивании.Превращение предшественника в целевой инсулин-гларгин контролируюткаждый час, оценивая процентное содержание рекомбинантного инсулинагларгина и непрореагировавшего предшественника с помощью аналитического метода ОФ ВЭЖХ (С18). Реакция протекает менее чем за 10 ч.
Гидролизостанавливают доведением pH до 5,0 ледяной уксусной кислотой, когда процент негидролизованного предшественника составляет менее 5%.Все три стадии хроматографической очистки проводят на ВЭЖХ колонне,упакованной сорбентом C8 Daisogel (Daiso, Япония).На первом этапе очистки колонну уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 250 мМ уксусной кислоте (буфер А). Раствор после обработки трипсином разбавляют в 5 раз водой. Для элюции используют линейный градиентс повышением содержания буфера В.На второй стадии колонну предварительно уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 200 мМ ацетате натрия до pH 5 (буфер А). Элюат послепредыдущей стадии должен содержать 10% ацетонитрила для нанесения наколонну (для чего образец разбавляют буфером А).
Белок элюируют буферомВ в линейном градиенте.Для завершающей стадии очистки колонну уравновешивают 6% этанолом(буфер В) в 50 мМ уксусной кислоте (буфер А). Элюат после предыдущейстадии разбавляют в 3 раза водой. Элюируют белок в линейном градиентебуфера В. Получают целевой белок с выходом примерно 85% и чистотой99,4% и выше.Очищенный с помощью трех стадий ВЭЖХ гларгин осаждают добавлениембуфера лимонной кислоты (15,4 г/л лимонная кислота, 90 г/л гидрофосфатнатрия) и раствора ZnCl2. Доводят рН до 6,3. После осаждения осадок белкаотделяют от надосадка центрифугированием и высушивают под вакуумом.Выход всего процесса составляет 85-90%; чистота АФС около 99%.F92Надо отметить, что данная технология базируется на использовании дрожжевого продуцента.
То есть авторы технологии предвидели значительные проблемы с выделением инсулина-гларгина и очисткой от эндотоксинов в случаеиспользования грамотрицательных бактерий в роли намного более эффективного продуцента. Описанная технология построена на том, что производительность всего «апстрим»-процесса принесена в жертву некоторому (неясно, насколько оправданному) облегчению последующего «даунстрим»-процесса. Действительно, заявленный выход процесса в 85-90% - такой большойименно потому, что небыло необходимости внедрять дополнительные стадииочистки от бактериальных липополисахаридов, белков клеток-хозяина и бактериальной ДНК – но вот насколько велика производительности всей технологии. По нашим расчетам, такая технология позволит производить не более10-12 г АФС с одного куб.м.
культуральной жидкости. Такая низкая производительность, несомненно, приведет к увеличению аппаратных мощностей иштатных единиц на производстве, а также к увеличению потребления реактивов и сырья, что опосредованно скажется на возрастании требований к экологической утилизации стоков. Очевидно, что такие низкопроизводительнаятехнология и, следовательно, значительная себестоимость финального продукта, АФС инсулина-гларгина, главным образом продиктованы отсутсвиемпрямой конкуренции авторам технологии.5.2.
Интерферон-гаммаЧеловеческий интерферон-гамма (Инт-Г) представляет собой собой белок смолекулярной массой около 16,7 кДа (145 а.о.). Инт-Г присущи антипролиферативная и противовоспалительная активности.Существуют лекарственные формы на основе Инт-Г, в частности Гаммаферон, он же Ингарон (Фармаклон, Россия), Имукин (Boehringer Ingelheim, Германия), Actimmune (InterMune, сейчас в составе Amgen, США). В нашейстране зарегистриваны первые два, но в настоящее время выпуск Ингаронакомпанией Фармаклон прекращен.
Зарубежный аналог Имукин крайне слож-F93но купить, так как он практически не импортируется. Таким образом, в нашей стране существует огромная потребность в рекомбинантном Инт-Г, дляпрепаратов которого существует отличная маркетинговая «ниша».5.2.1. Процесс «upstream»Существует несколько способов получения Инт-Г, и все они не лишены недостатков. Например, получение рекомбинантного белка в клетках яичника китайских хомячков характеризуется длительным временем экспрессии (4-6 суток) и низким выходом целевого белка (200-600 млн Ед/л культуры клеток)[310]. Этот метод носит скорее научный интерес, так как абсолютно нерента‑белен с рыночной точки зрения.Известен ряд способов получения Инт-Г путем бактериальной экспрессии,что для такого простого (мономерный, негликозилированный, несубъединичный, достаточно небольшой) белка является, несомненно, грамотным выбором, потому что может позволить производить вполне рентабельные препараты на основе Инт-Г.
Один из способов включает культивирование штамма Е.coli, трансформированного плазмидой pgif315 [311]. В другом способе опи‑сана плазмида pTTg Km2, кодирующая синтез Инт-Г человека, содержащаятриптофановый промотор из генома E. Coli, синтетическую последовательность участка связывания рибосом [312]. Для обоих способов характерным‑недостатком являются крайне низкие выходы биосинтеза (около 1 мг белка с1 г биомассы), что связано с затруднениями, возникающими в процессе денатурации и растворения тел включения [313].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
