Главная » Просмотр файлов » Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков

Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305), страница 18

Файл №1090305 Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (Разработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков) 18 страницаРазработка научных основ создания технологии выделения и очистки генно-инженерных белков (1090305) страница 182018-01-18СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 18)

В качестве буфера используют фосфат натрия илисульфат аммония, также буфер должен содержать антиоксидант, например Lметионин.Заключительным этапом является ОФ ВЭЖХ, которую предпочтительно проводить на сорбенте SOURCE 30 RPC (GE Healthcare) при комнатной температуре с использованием слегка щелочной мобильной буферной фазы, например ацетата аммонния, рН 7,0-8,5. Буферный раствор на данном этапе очистки содержит органические модификаторы, концентрация которых изменяетсядля различных этапов хроматографии (уравновешивание колонки, нанесениеобразца, элюирование и регенерация). В качестве органических модификаторов используют водорастворимые органические растворители, напримерспирты (метанол, этанол и др.), чаще всего изопропанол.Дополнительно также проводят очистку методом анионообменной хроматографии, где в качестве сорбента используют Q Sepharose FF (GE Healthcare).Ионообменную хроматографию предпочтительно проводить с использованием буфера с умеренно щелочной средой (рН около 8,5).

Подходящими буферами являются, например, боратный буфер, триэтаноламин / трис, ацетат аммония, бицин, TES, HEPES. Наиболее предпочтительным является боратныйбуфер, рН 8,5. Элюирование достигается за счет увеличения электропроводности подвижной фазы (добавления соли NaCl).До шага ионообменной хроматографии, может быть проведена ультрафильтрация (или диафильтрация), которую предпочтительно проводить с использованием мембран с пределом отсечения 8 кДа при 2-8˚С.Дополнительно проводят еще одну очистку - второй этап анионообменнойхроматографии.F100В качестве полимера используют Fractogel EMD TMAE HICAP (Merck, Германия).

Кроме того, второй этап анионообменной хроматографии может бытьосуществлен на Q Sepharose FF.Дополнительным этапом выделения является ультрафильтрация/диафильтрация [319].‑В одном из методов очистки после любой из ступеней хроматографии (особенно после ОФ ВЭЖХ) образец ФСГ подвергают концентрированию предпочтительно ультрафильтрацией, проводимой с использованием мембран спределом отсечения 5 кДа.Все перечисленные этапы очистки ФСГ желательно проводить в следующемпорядке:1. Ультрафильтрация (мембрана с пределом отсечения 8 кДа).2.

Анионообменная хроматография (с использованием Q Sepharose FF).3. Аффинная хроматография с использованием красителя (Blue Dye SepharoseFF).4. ХГВ с использованием Phenyl Toyoperl 650M.5. ОФ ВЭЖХ (Source 30RPC).6. Анионообменная хроматография (Fractogel END TMAE HICAP).7. Ультрафильтрация (мембрана с пределом отсечения 5 кДа).Для удаления вирусов, снижения риска загрязнения ФСГ вирусами из клеточной культуры необходимо проводить нанофильтрацию.

Ее можно сделатьна любой стадии процесса очистки при 2-8°C, однако логичнее всего после 2го этапа ионообменной хроматографии или после ОФ ВЭЖХ [67].Очищенные фракции ФСГ замораживают и лиофилизируют для полученияполноценной АФС [320].‑Описанная технологическая схема с теми или иными минорными модификациями принята на производстве ФСГ у крупнейших мировых поставщиков,компаниях Мерк-Сероно (Швейцария) и Органон (Нидерланды). Из представленного описания видно, что технология крайне сложная, насыщеннаябольшим количеством стадий (в основном, хроматографических).

Это принципиальным образом сказывается на себестоимости получаемого препарата иF101сложности организации менеджмента системы качества, включая и валидацию процессов, и анализ возможных рисков. Кроме того, по новым требованиям (пока негласным – на момент написания диссертации уже были поданысоответствующие предложения на рассмотрение комиссии FDA, но еще непринятые) европейских и американских регламентирующих органов, такихкак ICH и FDA, в производстве рекомбинантных белков из клеток млекопитающих должны быть интегрированы как минимум три ортогональных метода избавления от наиболее опасных примесей, вирусов. В данной схемеочистка от вирусов осуществляется двумя ортогональными методами: хроматографией и нанофильтрацией.

Этого может быть недостаточно для уверенного обеспечения вирусной безопасности продукта.Еще одним недостатком представленной схемы является наличие ОФ ВЭЖХ.Хотя это наиболее эффективный способ очистки от ряда примесей, он требует использования органических растворителей, которые частично денатурируют ФСГ и снижают его активность. Использование ОФ ВЭЖХ, как мы себеэто видим, является своего рода необходимым компромиссом: стадию использовать приходится тогда, когда очистка на ХГВ не достаточно оптимизирована и не приводит к получению продукта желаемого качества. Несомненно, при грамотной оптимизации ХГВ или разработке альтернативного методаочистки можно было бы избежать использования ОФ ВЭЖХ.F102РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕПри выполнении диссертационного исследования был проведен ряд разработок, имеющих цель – создать высокоэффективные и конкурентноспособныепромышленные технологии выделения и очистки таких биофармацевтических объектов, как человеческий инсулин, инсулин-гларгин, N,N-бисметионилгистон Н1.3, интерферон-гамма, фолликулостимулирующий гормон.Именно на примере этих объектов была разработана унифицированная концепция выделения и очистки практически любых генно-инженерных белков.Концепция подразумевает методологический алгоритм, который структурированно позволяет опеределить важные, ключевые стадии технологии«downstream» процесса.При этом, совершенно очевидно, что для разработки и последующего внедрения в производство к таким технологиям следует предъявлять следующиетребования:(1).

Методика должна быть приемлемой для получения продукта с большимвыходом. Несмотря на высокое содержание различных примесей в растворецелевого белка, выделяемого из культуральной жидкости, технология очисткидолжна обеспечивать такую степень чистоты, которая требуется спецификацией на готовый продукт.(2). Операционные параметры должны быть совместимы с физико-химическими свойствами молекулы рекомбинантного белка.(3). Технологические условия должны обеспечивать хорошую растворимостьбелка.(4).

Технологические стадии должны быть взаимно совместимы.(5). Процесс должен быть экономически выгоден.Выполнение этих требований обязательно для рентабельного и высокоэффективного производства.F1031. Создание промышленной технологии выделения и очисткичеловеческого инсулина в производстве препарата-биодженерика.Инсулин является, пожалуй, самым изученным соединением белковой природы, и, по сути, первым из рекомбинантных биофармацевтических лекарственных средств.

До сих пор терапия инсулином не имеет альтернатив дляпациента, страдающего сахарным диабетом. Поэтому производство инсулинаявляется стратегически важным для любой страны, чье население достаточновелико и превышает 50 млн человек.Как мы уже говорили, инсулин состоит из 51 а.о., имеет массу 5808 Да, а егоизоэлектрическая точка pI=5.4 (Рисунок 19).FРисунок 19. Аминокислотная последовательность молекулы ГИЧ. Красным цветом показаны остаткицистеинов, образующие три дисульфидные связи.Разработка эффективной технологии получения ГИЧ заключается не только всоздании высокопродуктивного штамма, но и в оптимизации всех стадийпроизводства, начиная от выделения рекомбинантного белка-предшественника (РП) из тел включения и заканчивая финишной очисткой ИГ. Основныеэтапы производства заключаются в выделении РП из ТВ, восстановлении(денатурация), ренатурация (рефолдинг) и очистке РП; после ферментативного расщепления РП образуется ГИЧ, который подвергается очистке хроматографическими методами; очищенный ГИЧ кристаллизуют, а кристаллы лиофильно высушивают.Первый этап технологии - получение полупродукта, белка-предшественникаинсулина (РП).

Этот этап мы начали с разработки и валидации метода анализа РП.F1041.1. Разработка внутрипроизводственного контроля содержаниямономера РП в растворах.Определение мономерной чистоты и концентрации рекомбинантного предшественника ГИЧ является необходимой аналитической стадией, позволяющей контролировать технологический процесс выделения РП.Исходя из разницы в молекулярных массах мономера РП и его мультимерныхформ, наиболее подходящим методом для определения процентного содержания и концентрации мономера РП в растворах восстановленного и ренатурированного белка является высокоэффективная эксклюзионная хроматография (SEC). Во-первых, SEC обладает всеми достоинствами ВЭЖХ, а именно:селективностью, экспрессностью и воспроизводимостью.

Кроме того, методика проведения SEC не подразумевает наличия дорогостоящего прецизионного градиентного оборудования.Ранее данный метод с успехом применялся для анализа инсулина и инсулиноподобных примесей [321, 322]. Однако для подобного SEC-анализа рекомби‑‑нантных белков в качестве неподвижной фазы обычно используются полимерные матрицы, несмотря на их низкую стабильность при высоких давлениях [323].

Наиболее распространены сорбенты на основе полиметакрилата и‑сополимера стирола и дивинилбензола. В данной работе для анализа содержания мономерной формы в растворах РП нами предложено использоватьметод SEC на основе силикагеля с привитыми диольными группами, обеспечивающими необходимую полярность матрицы и смачиваемость внутреннихпор (YMC-Diol).Все эксперименты проводили на контрольном стандарте, препарате«Лантус», обессоленном гель-фильтрацией и высушенном лиофильно.1.1.1. Подбор подвижной фазы.Подвижная фаза представляла собой раствор ацетонитрила (25% по об.) и уксусной кислоты (25% по об.) в воде для инъекций, также в состав подвижнойфазы был введен L-аргинин. Ацетонитрил был использован для увеличениясмачиваемости частиц сорбента, уксусная кислота – для выполнения анти-F105бактериальных функций, а также в качестве буферного агента для поддержания рН системы в пределах от 2.5 до 3.5 (рекомендуемый производителемдиапазон рН составляет 2.0-7.0), а L-аргинин – для улучшения эффективности колонки.

Известно, что с увеличением концентрации L-аргинин в составеподвижной фазы значительно увеличивается число теоретических ступенейпри изократических разделениях [324]. В результате проведённой работы‑было показано, что оптимальная концентрация L-аргинина в подвижной фазесоставляет 7 мг/мл (Рисунок 20). При этом эффективность колонки превышала 10 тыс. ч.т.т. (в выбранном диапазоне концентраций РП), поэтому дальнейшее увеличение концентрации аминокислоты в подвижной фазе нецелесообразно.F106FРисунок 20.

Сравнение эффективности работы хроматографической колонны в зависимости от концентрации L-аргинина в составе подвижной фазы: а - зависимость эффективности от номинальнойконцентрации РП; б – зависимость эффективности от концентрации L-аргинина в подвижной фазе.1.1.2. Определение оптимальной скорости элюирования.Определение оптимальной скорости элюции проводили с помощью построения графической характеристики Ван Димтра. Для этого определяли величи-F107ны высот колонки, эквивалентных теоретической тарелке (ВЭТТ) при различных скоростях потока, элюируя образец РП, инжектированный в колонкуво всех опытах в одинаковой концентрации.

Характеристики

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6367
Авторов
на СтудИзбе
310
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее